Name: Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Aprenda a preparar vetores lentivirais para modulação eficiente de genes em macrófagos residentes peritoneais in vivo em camundongos. Este método permite estudar funções imunometabólicas e interações celulares.

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<meta charset="utf8"></head><body>Preparação de vetor lentiviral para modulação gênica in vivo

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
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<li>Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+functions+of+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Origin and functions of tissue macrophages.</a> Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+local+environment+and+epigenetics+in+shaping+macrophage+identity+and+their+effect+on+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis.</a> Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).</li>
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<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Davies, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+tissue-resident+macrophages+are+metabolically+poised+to+engage+microbes+using+tissue-niche+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels.</a> Nat Commun. 8 (1), 2047(2017).</li>
<li>Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+driver+mice+targeting+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre driver mice targeting macrophages.</a> Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).</li>
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<li>Decalf, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+of+HIV-1+entry+triggers+a+Type+I+Interferon+response+in+human+primary+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages.</a> J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x) (Tripsina 500 mg/L ou 0,02 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro estéril millex GP</td><td>Merck</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtro estéril millex GP</td><td>Merck</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>seringa de insulina U-100 de 0,5 mL com agulha, 0,33 mm x 12,7 mm (29 G)</td><td>BD</td><td>324892</td><td></td></tr><tr><td>recipiente para objetos cortantes de 1 litro</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2.4G2 anticorpo (TruStain FcX anti-mouse CD16/32)</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; filtro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>meio AimV (grau de pesquisa), Suplemento AlbuMax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31035025</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de bloqueio</td><td>preparado em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio tioglicolato de cerveja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2551</td><td>Solução estoque a 4% preparada em água, autoclavada e mantida congelada.</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117317</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117333</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560375</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Biolegend</td><td>152410</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD226</td><td>Biolegend</td><td>128808</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>BD</td><td></td><td>560527 Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD3e</td><td>Biolegend</td><td>152313</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>100412</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD73</td><td>eBioscience</td><td>16-0731-82</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>CD8a</td><td>eBioscience</td><td>48-0081-82</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>Frasco de cultura de células (frasco T175, 175 cm2, 550 mL)</td><td>Greiner Bio One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, tubos de fundo cônico 25 mm x 89 mm</td><td>Centrífugas Beckman Coulter</td><td>358126</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Ultracentrífuga Beckman Coulter</td><td></td><td>e centrífuga TC</td></tr><tr><td>Colagenase tipo IV</td> Tubos de centrífuga cônicos <td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>(15 mL e 50 mL)</td><td>Greiner Bio One</td><td>11512303 & 11849650</td><td></td></tr><tr><td>Criotubos</td><td>Greiner Bio One</td><td>123277</td><td>ou criotubos</td></tr><tr><td>DMEM médio (1x) + 4,5g/L D-glicose, 400 &micro; M L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965-062</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123123</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123133</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td>123147</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>FceR1</td><td>eBioscience</td><td>48-5898-80</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td>inativado por calor por 30 min a 56 &graus; C e estéril filtrado através de 0,22 &mu; filtro m</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; Tampão de citometria de fluxo Attune NxT</td><td></td></tr><tr><td>(FACS)</td><td>preparado internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente de cultura de tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EVOS FL</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>N/A</td><td>N/A Preferência</td><td>do usuário</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank (HBSS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>Linha</td><td></td> <td>celular HEK293T</td><td>cultivado por pelo menos uma semana antes da transfecção. Antígeno central do HIV-1 livre de micoplasma</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>6604667</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Hydrex esfoliante cirúrgico, gluconato de clorexida 4% p/v limpador de pele</td><td>Ecolab</td><td>3037170</td><td></td></tr><tr><td>I-A/I-E</td><td>Biolegend</td><td>107625</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>ICAM1</td><td>Becton Dickinson</td><td>554970</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr> da <tr><td>linha</td><td></td><td></td> celular Jurkat T <td>cultivada por pelo menos uma semana antes do uso. Kit de coloração de</td></tr><tr><td>células mortas de infravermelho próximo corrigível VIVO/MORTO</td> livre de micoplasma <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L34975</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G</td><td>Biolegend</td><td>127615</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>Os camundongos</td><td></td><td></td><td>aqui usaram fêmeas C57BL/6, com idade entre 8 e 12 semanas (Charles Rivers), a menos que especificado de forma diferente</td></tr><tr><td>Pipetas microcapilares (faixa de volume 0,5-1.000 &mu; L)</td> <td>Fisher Científico & Starlab</td><td>11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700</td><td></td></tr><tr><td>NK1.1</td><td>Biolegend</td><td>108724</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>preparado a 2% p/v em PBS</td></tr><tr><td>pCMV-&Delta; Plasmídeo de embalagem R8.91</td><td>Zuffrey, R., et al. 1997</td> codifica a proteína Gag-Pol HIV impulsionada pelo promotor do citomegalovírus.<td></td><td> Resistência à ampicilina.</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (100x, 10.000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo pHR'SIN-cPPT-SEW</td><td>Rosas, M. et al. 2014</td> modificado para estudos de expressão de shRNA e miR.<td></td><td> Codifica o marcador EGFP a jusante do promotor SFFV e a montante do intensificador do vírus hepatitivo Woodchuck. Resistência à ampicilina.</td></tr><tr><td>O plasmídeo</td><td></td> pMD2.G <td>Naldini, L. et al. 1996</td><td>codifica o envelope da glicoproteína g do vírus da estomatite vesicular (VSV-G). Resistência à ampicilina.</td></tr><tr><td>Controle de isotipo IgG1 de rato, &kappa;</td><td>Becton Dickinson</td><td>550617</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração Soro</td></tr><tr><td>de rato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9759-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de lise ACK de sangue vermelho</td><td>preparado em casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio RPMI 1640 (1x) + 400 uM L-glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4521</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF</td><td>BD</td><td>562681</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr><tr><td>Comprimidos de hipoclorito de sódio (alvejante, 2.000 ppm)</td><td>Guest Medical</td><td>H8818</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células estéril de 24 poços</td><td>Greiner Bio One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>PBS estéril de Dulbecco (DPBS) (1x) Mg++ e Ca2+ - grátis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EDTA estéril</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência descartáveis VWR estéreis (23,0 mL, 30 cm)</td><td>VWR</td><td>612-4515</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>tesouras cirúrgicas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preferência do utilizador</td></tr><tr><td>Seringas (50 mL e 1 0 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10084450 & 768160</td><td></td></tr><tr><td>Tim4</td><td>Biolegend</td><td>130007</td><td>Consulte a Tabela 1 para a diluição e concentração</td></tr> da <tr><td>placa de cultura de células de 96 poços com fundo em U</td><td>Greiner Bio One</td><td>650180</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e micrornas de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue&#45;Resident Macrophages In Vivo in Mice

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

Peritoneal tissue-resident macrophages have broad functions in the maintenance of homeostasis and are involved in pathologies within local and neighboring ...

lentiviral-vector-preparation-for-efficient-gene-microrna-modulation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar...

Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral

Neste protocolo, descrevemos métodos para transfectar eficientemente linhagens celulares de macrófagos murinos com siRNAs usando o Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, estimular os macrófagos com lipopolissacarídeo e monitorar os efeitos na produção de citocinas inflamatórias.

Usando RNA-interferência para investigar a imunitário inatas de resposta em macrófagos

Descrevemos aqui um protocolo simples para isolar macrófagos peritoneais murinos. Este procedimento é seguido pela extração de RNA para realizar a análise da expressão gênica após a estimulação de receptores do tipo Toll.

Isolamento de Murino macrófagos peritoniais de Cumprir a análise de expressão gênica Após Toll-like receptors Estimulação

Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

Macrófagos, especialmente macrófagos primários, são um desafio para transfect como eles se especializam na detecção de moléculas de não-origem auto. Descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos.

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Esse protocolo visa introduzir um método para produzir e purificar biomiméticos extracelulares derivados de células-tronco mesenquimais (MSC) para terapia gênica. A nanovesícula é confinada com bicamadas lipídicas derivadas da MSC e encapsula AAVs recombinantes que carregam o gene de interesse no lúmen. Essa nanovesícula oferece um vetor aprimorado para a entrega de genes in vivo .

Desenvolvimento de Nanovesículas Envolvidas em Membrana por Células-Tronco Mesenquimatosas para Entrega Aprimorada de Genes

Aprenda a preparar vetores lentivirais para modulação eficiente de genes em macrófagos residentes peritoneais in vivo em camundongos. Este método permite estudar funções imunometabólicas e interações celulares.

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de vetor lentiviral para modulação eficiente de genes e microRNAs de macrófagos residentes no tecido da cavidade peritoneal in vivo em camundongos

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