Name: Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-27T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda o isolamento e identificação de células de nicho limbal humanas para medicina regenerativa e restauração da visão. Este método utiliza sequenciamento de célula única e imunofluorescência.

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Obrigado a Wei Wang, Lingjuan Xu e Rong Liu pela orientação sobre este trabalho, Yongyao Tan, Bihui Jin, Chunxiu You e Li Guigang por fornecerem parte do material, Guanyu Su por escrever o manuscrito, Xiao Zhou, Yihong Xiong e Huatao Xie por corrigirem o manuscrito e Guigang Li por sua orientação completa. Este estudo foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 82070936, 81470606, 81570819), projeto de pesquisa científica de saúde e planejamento familiar da província de Hubei (No. WJ2017M073), Top Ten Projetos de Pesquisa Médica Translacional do Hospital Tongji (No.2016ZHYX20), Projeto de Treinamento de Jovens Pioneiros Médicos na Cidade de Wuhan (No.2015whzqnyxggrc10), Programa Global de Recrutamento de Talentos (G2022154028L), Projeto da Comissão Nacional de Saúde da Província de Hubei em 2022(WJ2021ZH0005) e Fundação de Construção de Assunto do Departamento de Finanças de Hubei em 2022(42000022815T000000102)

O tecido do limbo de doadores com idade entre 50 e 60 anos foi obtido do Banco de Olhos da Cruz Vermelha, Hospital Tongji (Wuhan, China). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Tongji e foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque.
1. Isolamento
<ol><li>Obter tecido do limbo a partir de meio de armazenamento corneano de médio prazo intermediário e operar sob condições assépticas em uma bancada de trabalho ultralimpa.</li>
	<li>Raspar e remover a íris e o endotélio ao redor da córnea usando uma lâmina redonda cirúrgica estéril.</li>
	<li>Cortar o tecido do limbo em doze pedaços de tamanho igual com uma lâmina cirúrgica com 1 mm à esquerda em ambos os lados da córnea e esclera.</li>
	<li>Transfira os tecidos do limbo para uma placa de cultura de 3,5 cm, adicione 1 mL de colagenase A (2 mg/mL, em meio DF-12), para imergir todos os tecidos para digestão.</li>
	<li>Coloque a placa na incubadora de células a 37 °C, digerir os tecidos límbicos durante 18 horas. NOTA: Os procedimentos de acompanhamento são geralmente realizados no segundo dia.</li>
	<li>Preparar uma matriz de membrana basal (Matrigel) revestida com 5% de placa de cultura de 6 poços.<ol><li>Revestir 5% de matriz de membrana basal (dissolvida em MESCM [Tabela 1]) no fundo do poço.</li>
		<li>Preparar pontas de 200 μL e 1 mL, um tubo centrífugo de 15 mL e uma placa de 6 poços em uma bolsa esterilizada.</li>
		<li>Coloque o saco esterilizado (incluindo pontas e tubo centrífugo) e uma nova placa de 6 poços a ambientes de -20 °C ou -80 °C por 20 min. Descongelar a matriz da membrana basal no refrigerador a 4 °C.</li>
		<li>Retire as pontas pré-resfriadas, o tubo centrífugo e a placa de 6 poços do ambiente de -20 °C ou -80 °C e, em seguida, execute as seguintes operações na bancada de trabalho ultralimpa.</li>
		<li>Transfira 50 μL de matriz de membrana basal a 5% para 1 mL de MESCM usando uma ponta de 200 μL e misture-os suavemente e uniformemente.</li>
		<li>Transfira a matriz da membrana basal a 5% (dissolvida em MESCM) para um poço de uma placa de cultura de 6 poços usando a ponta pré-resfriada de 1 mL.</li>
		<li>Agite a placa de 6 poços suave e horizontalmente, coloque a placa de cultura de 6 poços na incubadora de células a 37 °C por aproximadamente 1 h e, em seguida, execute a próxima etapa.</li>
	</ol></li>
	<li>Após 18 horas de digestão, retire o tecido límbico digerido pela colagenase A, apenas alguns pequenos aglomerados visíveis e tecidos esclerais não digeridos permanecerão. NOTA: A microscopia de alta magnificação revela um aglomerado composto por muitas células densamente compactadas (incluindo LNCs).</li>
	<li>Use uma ponta de pipeta de 200 μL para separar os cachos dos tecidos esclerais não digeridos sob o estereomicroscópio.</li>
	<li>Transfira os cachos para a placa de cultura de 3,5 cm e mergulhe-os em TA 0,25% e, em seguida, coloque a placa na incubadora de células por 15 min.</li>
	<li>Adicione 1 mL de MESCM com 10% de soro nocaute para interromper a digestão celular e pipetar suavemente para cima e para baixo para ressuspender os aglomerados em células individuais usando uma ponta de pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para um tubo centrífugo de 15 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min.</li>
	<li>Remova o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar a precipitação celular e, em seguida, adicione 1 mL de MESCM para ressuspender as células.</li>
	<li>Pipetar para cima e para baixo 2-3 vezes até que a precipitação da célula de fundo seja uniformemente suspensa no MESCM usando a ponta da pipeta de 1 mL e tomar a suspensão de 20 μL de células para contagem celular.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular para a placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal a 5% com ponta de pipeta de 1 mL e aumente o volume de MESCM para 2,5 mL.</li>
	<li>Agite suavemente a placa de 6 poços horizontalmente para distribuir uniformemente as células.</li>
	<li>Transferir as células para a incubadora de cultura após serem fotografadas e registradas. Observe e fotografe as células diariamente, e troque o meio a cada 3-4 dias.</li>
</ol>2. Identificação do LNC
<ol><li>Coloração por imunofluorescência<ol><li>Digerir os LNCs do fundo da placa usando 1 mL de TE 0,25% por 5 min na incubadora de células a 37°C.</li>
		<li>Terminar a digestão adicionando 1 mL de MESCM (contendo soro nocaute), centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante cuidadosamente.</li>
		<li>Adicionar 1 ml de MESCM para ressuspender as células em suspensão. Preparar a suspensão celular de 80 μL (4 × 103 células por lâmina) para 4 lâminas (20 μL/lâmina) e usar o sistema de centrífuga para depositar as células nas lâminas do microscópio de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Fixar as células (aderidas às lâminas na etapa 3) usando paraformaldeído a 4% por cerca de 10 min e, em seguida, permeabilizar as células nas lâminas com Triton X-100 a 0,2% em PBS por 15 min.</li>
		<li>Bloquear as células por 1 h com albumina de soro bovino (BSA) a 2% antes de incubá-las com anticorpos primários (Pan-CK [1:1000], Vim [1:100], CD90 [1:100], CD105 [1:200], SCF [1:100], PDGFRβ [1:100]) em um agitador durante a noite a 4 °C. Após a incubação, remover os anticorpos primários não ligados lavando (5 min/lavagem, 3x) as lâminas com PBST (PBS + 0,1% Tween 20).</li>
		<li>Incubar os anticorpos secundários correspondentes (anticorpo secundário IgG de burro anti-rato TRITC [1:1000], burro anti-coelho IgG FITC [1:500], burro anti-rato IgG 488 [1:300], burro anti-coelho IgG 594 [1:400]) durante 1 h com anticorpos IgG inespecíficos IgG adequados. Remova o anticorpo secundário não ligado usando PBST (5 min/lavagem, 3x).</li>
		<li>Contracolorir os núcleos com 5 μg/mL de DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol ) e selar as lâminas.</li>
		<li>Realizar imagens de fluorescência usando um microscópio de fluorescência (Ampliação: 400x; Tempo de exposição: 50 ms).</li>
	</ol></li>
	<li>Reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR)<ol><li>Tome o Kit de Isolamento de RNA para extrair o RNA total de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Use um Kit de Transcrição de cDNA de alta capacidade para transcrever reversamente 1-2 μg de RNA total para cDNA.</li>
		<li>Realizar a transcrição reversa (42 °C, 2 min; 50 °C, 85 min) e qPCR (95 °C, 5 min; 95 °C, 10 s, 40 ciclos) em uma solução de 20 μL contendo cDNA (100 ng), TaqMan Gene Expression Assay Mix (1 μL), PCR universal Master Mix (10 μL) e ddH2O (até 20 μL).</li>
		<li>Utilizar a técnica de TC comparativa (ΔΔCT)4,9 para examinar a expressão gênica relativa.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Caracterização do LNC
<ol><li>Contagem celular (hemocitômetro)<ol><li>Digerir os LNCs do fundo da placa usando TE 0,25% por 5 min na incubadora de células a 37 °C.</li>
		<li>Terminar a digestão adicionando 1 mL de MESCM (contendo soro nocaute), centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante cuidadosamente.</li>
		<li>Adicionar 1 ml de MESCM para ressuspender as células e, em seguida, tomar 10 μL de suspensão celular num tubo de centrífuga de 0,5 ml. Adicione um volume igual de solução corante de azul de Trypan a 0,4%.</li>
		<li>Colocar a suspensão celular corada de 10 μL na área de contagem do hemocitômetro e cobri-la com uma lamínula para contagem. Observação : o número de células nas cinco áreas quadradas do meio é definido como "A"; o número de células em 1 mL é calculado como 5A × 10,4 × 2.</li>
	</ol></li>
	<li>Exame dos marcadores LNC e BMMSC por citometria de fluxo15<ol><li>Detectar a expressão de SCF, CD73, CD90 e CD105 nos LNCs e BMMSCs utilizando citometria de fluxo15 (2-4 ×10 6 eventos/amostra, 2.000 células foram obtidas de cada uma das amostras, totalizando 550.000 células que foram fechadas simultaneamente).</li>
		<li>Coletar e corar as células a 20-30 °C por 15 min em um tampão de bloqueio (3% BSA e 0,05% Tween-20 em PBS) usando anticorpos pré-marcados (SCF [1:50], CD70 [1:50], CD90 [1:50] e CD105 [1:50]) de acordo com as instruções do kit.</li>
		<li>Realizar análise de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) usando um citômetro de fluxo. Neste estudo, foram utilizados os softwares FACS Diva e FlowJo. Para cada amostra, registre 10.000 eventos e analise células vivas.</li>
	</ol></li>
</ol>

Um protocolo para isolar, cultivar e identificar células de nicho límbico humano

<ol><li>Le, Q., Xu, J., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+limbal+stem+cell+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of limbal stem cell deficiency.</a> Ocular Surface. 16 (1), 58-69 (2018).</li>
<li>Polisetty, N., Fatima, A., Madhira, S. L., Sangwan, V. S., Vemuganti, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+from+limbal+stroma+of+human+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye.</a> Molecular Vision. 14, 431-442 (2008).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (1), 279-286 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Zhu, Y. T., Xie, H. T., Chen, S. Y., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+limbal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5686-5697 (2012).</li>
<li>Li, G. G., Chen, S. Y., Xie, H. T., Zhu, Y. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+potential+of+human+limbal+stromal+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis potential of human limbal stromal niche cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3357-3367 (2012).</li>
<li>Hu, W., Zhang, Y., Tighe, S., Zhu, Y. T., Li, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+lacrimal+canaliculus+epithelial+stem+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human lacrimal canaliculus epithelial stem cells by maintaining close association with their niche cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 15 (12), 1260-1267 (2018).</li>
<li>Kumar, A., Xu, Y., Yang, E., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemness+and+regenerative+potential+of+corneal+stromal+stem+cells+and+their+secretome+after+long-term+storage%3A+Implications+for+ocular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Stemness and regenerative potential of corneal stromal stem cells and their secretome after long-term storage: Implications for ocular regeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3728-3738 (2018).</li>
<li>Xiao, Y. T., Qu, J. Y., Xie, H. T., Zhang, M. C., Zhao, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+for+isolation+of+limbal+niche+cells%3A+Maintenance+of+limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods for isolation of limbal niche cells: Maintenance of limbal epithelial stem/progenitor cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 61 (14), 16(2020).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+and+three-dimensional+matrigel-induced+dedifferentiation+of+mature+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells and three-dimensional matrigel-induced dedifferentiation of mature corneal epithelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 63 (5), 1(2022).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+biopsy-derived+stromal+stem+cells+prevent+corneal+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human limbal biopsy-derived stromal stem cells prevent corneal scarring.</a> Science Translational Medicine. 6 (266), 266ra172(2014).</li>
<li>Acar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+allogeneic+limbal+mesenchymal+stem+cell+therapy+in+corneal+healing%3A+role+of+administration+route%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of allogeneic limbal mesenchymal stem cell therapy in corneal healing: role of administration route.</a> Ophthalmic Research. 53 (2), 82-89 (2015).</li>
<li>Katikireddy, K. R., Dana, R., Jurkunas, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+potential+of+limbal+fibroblasts+and+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+to+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentiation potential of limbal fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells to corneal epithelial cells.</a> Stem Cells. 32 (3), 717-729 (2014).</li>
<li>Polisetti, N., Sharaf, L., Reinhard, T., Schlunck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+ex+vivo+expansion+of+limbal+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and ex vivo expansion of limbal mesenchymal stromal cells.</a> Bio-Protocols. 12 (14), e4471(2022).</li>
<li>Xie, H. T., Chen, S. Y., Li, G. G., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+attract+stromal+niche+cells+by+SDF-1%2FCXCR4+signaling+to+prevent+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Limbal epithelial stem/progenitor cells attract stromal niche cells by SDF-1/CXCR4 signaling to prevent differentiation.</a> Stem Cells. 29 (11), 1874-1885 (2011).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+limbal+niche+cells+are+a+powerful+regenerative+source+for+the+prevention+of+limbal+stem+cell+deficiency+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human limbal niche cells are a powerful regenerative source for the prevention of limbal stem cell deficiency in a rabbit model.</a> Scientific Reports. 8, 6566(2018).</li>
<li>Kumar, A., Yun, H., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+therapy+for+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+In+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative therapy for the cornea.</a> Progress In Retinal and Eye Research. 87, 101011(2022).</li>
<li>Pineda, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPineda%2C+R+%22World+Corneal+Blindness.+Foundations+of+Corneal+Disease%22">World Corneal Blindness. Foundations of Corneal Disease</a>. , Springer, Cham. 299-305 (2020).</li>
<li>Zieske, J. D., Guimarães, S. R., Hutcheon, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+keratocyte+proliferation+in+response+to+epithelial+debridement%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement.</a> Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).</li>
<li>Resnikoff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+data+on+visual+impairment+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global data on visual impairment in the year 2002.</a> Bulletin of the World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+bio-engineered+tissue+employing+3D+nanofiber-aerogel+scaffold+to+facilitate+LSCs+growth+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Limbal bio-engineered tissue employing 3D nanofiber-aerogel scaffold to facilitate LSCs growth and migration.</a> Macromolecular Bioscience. 22 (5), e2100441(2022).</li>
<li>Aghamirsalim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+hydrogels+for+ocular+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">3D printed hydrogels for ocular wound healing.</a> Biomedicines. 10 (7), 1562(2022).</li>
<li>Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+the+corneal+epithelium+using+limbal+stem+cells+or+alternative+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Repairing the corneal epithelium using limbal stem cells or alternative cell-based therapies.</a> Expert Opinion on Biological Therapy. 18 (5), 505-513 (2018).</li>
<li>Rohaina, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+limbal+stem+cell+deficient+corneal+surface+with+induced+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+on+amniotic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of limbal stem cell deficient corneal surface with induced human bone marrow mesenchymal stem cells on amniotic membrane.</a> Translational Research. 163 (3), 200-210 (2014).</li>
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<li>Yu, D., Chen, M., Sun, X., Ge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+into+corneal+epithelial-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse induced pluripotent stem cells into corneal epithelial-like cells.</a> Cell Biology International. 37 (1), 87-94 (2013).</li>
<li>Zeppieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+corneal+wound+healing+after+laser-induced+corneal+lesions+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for corneal wound healing after laser-induced corneal lesions in mice.</a> Journal of Clinical Medicine. 6 (12), 115(2017).</li>
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<li>Hayashi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+generation+of+multiple+ocular-like+cell+lineages+and+fabrication+of+functional+corneal+epithelial+cell+sheets+from+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Coordinated generation of multiple ocular-like cell lineages and fabrication of functional corneal epithelial cell sheets from human iPS cells.</a> Nature Protocols. 12 (4), 683-696 (2017).</li>
<li>Guo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limbal+niche+cells+are+a+potent+resource+of+adult+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Limbal niche cells are a potent resource of adult mesenchymal progenitors.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3315-3322 (2018).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+between+limbal+niche+progenitors+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression between limbal niche progenitors and bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 17 (4), 549-557 (2020).</li>
<li>González, S., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+native+limbal+stromal+cells+increases+the+expansion+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Presence of native limbal stromal cells increases the expansion efficiency of limbal stem/progenitor cells in culture.</a> Experimental Eye Research. 116, 169-176 (2013).</li>
<li>Funderburgh, M. L., Du, Y., Mann, M. M., SundarRaj, N., Funderburgh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6+expression+identifies+progenitor+cells+for+corneal+keratocytes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">PAX6 expression identifies progenitor cells for corneal keratocytes.</a> FASEB Journal. 19 (10), 1371-1373 (2005).</li>
<li>Funderburgh, J. L., Funderburgh, M. L., Du, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+limbal+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the limbal stroma.</a> Ocular Surface. 14 (2), 113-120 (2016).</li>
<li>Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+isolation+method+of+human+limbal+progenitor+cells+by+maintaining+close+association+with+their+niche+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 17 (5), 537-548 (2011).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Growing+organoids+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Growing organoids from stem cells.</a> Cell. 161 (7), 1700-1701 (2015).</li>
</ol>

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A transparência corneana é tipicamente mantida pelo arranjo e distribuição regulares de pequenas fibras (25-30 nm de diâmetro) no estroma corneano, o que é crucial para a acuidade visual normal16. Existem 253 milhões de deficientes visuais em todo o mundo, dos quais 36 milhões são cegos17. A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera a cegueira corneana um dos mais sérios agravos à visão humana, sendo responsável por 5,1% de toda a cegueira no mundo16</s...

A incidência de deficiência de células-tronco epiteliais corneanas (CESD), também chamada de deficiência de células-tronco do limbo (LSCD)1, e regeneração epitelial corneana (ECC) estão se tornando cada vez mais urgentes devido à infecção e lesão corneana. Se não tratada adequadamente, a CESD pode levar à cegueira que requer transplante de córnea. Como resultado, a regeneração da CES está se tornando mais significativa. Existe um grupo de células de suporte chamadas células de nicho limbal (LNCs) que fornecem suporte essencial para a função da CES. As células-tronco estromais do limbo foram primeiramente isoladas por Polisetty et al.2 e identificadas por Xie et al.3 como CNLs que estão localizadas no epitélio limbal subjacente e estroma do limbo. Os NCLs são as principais células-tronco de suporte da borda corneana e, com a função de CTMs derivadas da medula óssea (BMMSCs), e podem ser induzidos a se desenvolver em células epiteliais da córnea e células estromais da córnea, etc.3,4,5,6,7. Estudos anteriores mostraram que as qualidades de células-tronco dos LNCs são mais primitivas do que as BMMSCs8, que já são amplamente utilizadas na clínica. Os LNCs podem até se tornar a próxima opção viável após as CTM, especialmente para o tratamento de CESD. Como importantes células de suporte para a CES, os LNCs também são células-tronco derivadas da estrutura de "nicho" do limbo. Os NCLs podem desempenhar um papel fundamental na desdiferenciação de células epiteliais maduras da córnea (MCEC) para a CES9. No entanto, os estudos sobre NCL ainda são relativamente insuficientes, e não há consenso sobre a terminologia, isolamento, purificação, identificação e características dos NCL. Alguns pesquisadores denominaram células-tronco estromais derivadas de biópsia limbal 10, células-tronco mesenquimais do limbo 11, células-tronco fibroblásticas do limbo12 e células estromais mesenquimais do limbo13. Como as características de crescimento dos NCN não foram descritas em detalhes, e devido às suas promissoras aplicações científicas e clínicas, e podem ser uma das ferramentas clínicas mais importantes no futuro, é necessário resumir o isolamento, purificação, identificação e características dos NCL.
De acordo com estudoprévio14, os NCL estão presentes principalmente no epitélio limbal subjacente e no estroma do limbo. Esse protocolo inclui o tratamento do tecido do limbo com colagenase A, a obtenção de um cluster composto por LEPC e LNCs e a digestão em células únicas com tripsina-EDTA (ET) a 0,25%. Os NCL foram então cultivados seletivamente em um meio de células-tronco embrionárias modificado (MESCM) para serem purificados. O protocolo relatado neste trabalho é simples e tem alta eficiência na obtenção de NCLs humanos em grandes quantidades.
O procedimento detalhado de isolamento, cultura e identificação do LNC foi gravado no vídeo para cientistas interessados no estudo do LNC, e pode ser convenientemente repetido quando necessário.

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-Fenylindole</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>5&mu; g / mL</td></tr><tr><td>de anfotericina B</td><td>Sigma</td><td>V900919</td><td>1,25 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-CD73</td><td>Abcam</td><td>ab202122</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>MERCK</td><td>A1933-CD105</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Proteintech</td><td>67075-1-Ig</td><td>1:200</td></tr><tr><td>CD105</td><td>Abcam</td><td>ab114052</td><td>1:50</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Proteintech</td><td>66766-1-Ig</td><td>1:100</td></tr><tr><td>CD90</td><td>Abcam</td><td>ab307736</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Incubadora de Células</td><td>Shanghai Lishen</td><td>K1119K4644</td><td>HF90(HT)</td></tr><tr><td>Sistema de centrífuga</td><td>StatSpin&nbsp;</td><td>StatSpin CytoFuge</td> <td>12-Collagenase</td></tr> <tr><td>A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>LSM700-Placa</td> <td>de</td></tr> <tr><td>cultura</td><td>3500356</td><td></td><td>35 mm</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)&nbsp;</td><td>cytiva</td><td>SH30023.01</td><td>90%</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) de burro</td><td>ThermoFisher</td><td>A16016</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) de burro</td><td>ThermoFisher</td><td>31568</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>FACS Software Diva BD</td><td>Biosciences</td><td>Tree</td> <td>Star-Flow</td></tr> <tr><td>Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>Becton Dickinson LSRII</td><td>-</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>olympus</td><td>cx31&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>50 &mu; Hemocitômetro g/mL</td></tr><tr><td></td><td>MERCK</td><td>Z359629</td><td>Kit de</td></tr><tr><td>Transcrição de cDNA de Alta Capacidade</td><td>Bright-Line ThermoFisher</td><td>4374966</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de contraste de fase invertida</td><td>&nbsp; UOP</td><td>DSZ2000X</td><td></td></tr><tr><td>ITS (insulina, transferrina, selenito de sódio)</td> <td>Sigma</td><td>I3146</td><td>5 &mu; g/mL de insulina, 5 &mu; g/mL de transferrina, 5 ng/mL de selenito de sódio</td></tr><tr><td>KnockOut SR Substituição de soro para ESCs/iPSCs</td><td>gibco</td><td>10828-028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BioCoat</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>356234-Pan-CK</td><td>Abcam</td><td>ab7753</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>NoninBio</td><td>NBS0135</td><td>4.00%</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>MKBio</td><td>MM-1505</td><td>4%</td></tr><tr><td>PDGFR&beta;</td><td>Abclonal</td><td>A1444</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Instrumento de PCR quantitativo de fluorescência em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>Step One</td><td></td></tr> <tr><td>Plus-Recombinante Humano FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>4 ng/mL</td></tr><tr><td>Recominant Fator Inibidor de Leucemia Humana(Lif)</td><td>Peprotech</td><td>300-05</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit de Isolamento de RNA</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>-</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Bioss</td><td>bs-0545R</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Abcam</td><td>ab52603</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>ZEISS</td><td>SteREO Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina redonda cirúrgica estéril</td><td>Careforde</td><td>29500</td><td>tamanho 10</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4448489</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MERCK</td><td>X100</td><td>0,20%</td></tr> <tr><td>Trypan azul</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>0,40%</td></tr> <tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Genview</td><td>GP3108</td><td>0,25%</td></tr> <tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>P9416-Ultra</td><td></td></tr> <tr><td>Clean Bench</td><td>LaiTe</td><td>LT20200705</td><td>SW-CJ-IFDG</td></tr><tr><td>Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Vim&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab92547</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

isolamento e identificação de células de nicho limbal

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Relatamos aqui um procedimento padrão para o isolamento e identificação de células de nicho limbal (LNCs). Tecido do limbo obtido de um banco de olhos foi utilizado para o isolamento dos NCN. O tecido foi dividido em 12 pedaços sob condições assépticas e digerido por 18 h a 37 °C em incubadora de cultura celular usando colagenase A para obter aglomerados celulares com CNLS e células progenitoras epiteliais límbicas. Os aglomerados celulares foram posteriormente digeridos por 15 min a 37 °C usando tripsina-EDTA a 0,25% para obtenção de células únicas e, em seguida, cultivados em meio de células-tronco embrionárias modificado (MESCM) em uma superfície plástica revestida com Matrigel a 5%. As células foram passadas em confluência de 70%, e os LNCs foram identificados por imunofluorescência, PCR quantitativo em tempo real (qPCR) e citometria de fluxo. Os NCL primários foram isolados e passados mais de 12 vezes. A atividade proliferativa de LNCs de P4 a P6 foi a mais alta. Os LNCs expressaram marcadores de células-tronco mais elevados do que os BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR e PDGFRβ). Além disso, os resultados mostraram que os LNCs P4 expressaram uniformemente VIM, CD90, CD105 e PDGFRβ, mas não Pan-CK, o que poderia ser usado como um marcador para a identificação de LNCs. A análise por citometria de fluxo mostrou que aproximadamente 95%, 97%, 92% e 11% dos LNCs expressaram CD73, CD90, CD105 e SCF, respectivamente, enquanto foram 68%, 99%, 20% e 3% nos BMMSCs. O processo padrão para isolamento e identificação de LNC poderia fornecer uma base laboratorial confiável para o uso generalizado de LNCs.

Crescimento do LNC Os NCL foram isolados com sucesso de acordo com o método de digestão da colagenase A (2 mg/mL) do tecido da borda corneoescleral, conforme descrito acima (Figura 1). Consistente com um estudo relatado anteriormente3, após a digestão da colagenase A, aglomerados semelhantes a lagartas foram visualizados ao microscópio (Figura 2). A proporção de células fusiformes aumentou gradualmente com a passagem c...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e identificar as células do nicho limbal humano.

Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Nossos estudos se concentram na reconstrução do nicho limbal para tratar a deficiência de células-tronco do limbo e restaurar a visão do paciente. Estamos tentando responder se as células de nicho limbal são ou não as células-chave que suportam a função das células-tronco do limbo e, em caso afirmativo, como funciona. Estudos recentes relataram que o transplante subconjuntival de células-tronco mesenquimais da medula óssea preveniu a deficiência de células-tronco límbicas de olhos queimados por álcalis.Uma das tecnologias atualmente utilizadas para avançar nossa pesquisa é o sequenciamento unicelular, que pode analisar as principais atividades da via de sinalização em nível de célula única para a caracterização de células de nicho limbal. Embora o LNC tenha o potencial de se tornar uma ferramenta clínica importante no futuro, suas características de crescimento ainda não foram exploradas em muitos detalhes. Considerando suas promissoras aplicações científicas e clínicas, é necessário resumir o isolamento, purificação, identificação e características do LNC.

isolation-and-identification-of-limbal-niche-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas.

Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

Neste artigo, descrevemos os princípios para projetar e realizar um experimento de rastreamento de linhagem multicolorido usando camundongos R26R-Confetti. Fornecemos um protocolo específico para rastreamento de células epiteliais da córnea que podem ser modificadas para outros tecidos de interesse.

Um método para Lineage Tracing de células da córnea Usando Multi-cor repórter fluorescente Mice

Um exemplo de terapia genética adenoviral nas córneas cultivadas de órgãos diabéticos humanos é apresentado para a normalização da cicatrização tardia de feridas e expressão de marcadores de células-tronco epiteliais marcadamente reduzida nessas córneas. Também descreve a otimização desse processo em culturas epiteliais límbicas enriquecidas com células-tronco.

Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal

O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

A superfície ocular normal exposta consiste em córnea e conjuntiva. As células epiteliais, as células caliciformes e as células imunes estão presentes na conjuntiva. Aqui, uma técnica não invasiva de citologia de impressão é descrita usando um dispositivo de citação de impressão e citometria de fluxo para analisar células imunes na conjuntiva.

Uma maneira não invasiva de isolar e células de fenótipo da Conjuntiva

Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.

Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento e amplificação de bactérias comensais anaeróbicas aeróbicas e facultativas de camundongos anastrérmicos utilizando um cotonete de olho único e passo de enriquecimento baseado em cultura com identificação subsequente por métodos à base microbiológica e espectrometria de massa MALDI-TOF.

Isolamento e Identificação Conjuntivival Commensal em Camundongos

Este protocolo descreve um método para induzir uma lesão córnea e límbica precisa e reprodutível em um modelo de camundongo. O protocolo é vantajoso, pois permite uma lesão uniformemente distribuída na córnea e no limbo de camundongos altamente curvos.

Indução de lesão de córnea e límplice alcalino pela técnica punch-trephine em modelo murino

Desenvolvemos um modelo de rato de inflamação grave da córnea por meio de curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea. O estudo avaliou os padrões de inflamação da córnea, proliferação epitelial e alterações nas células-tronco límbicas sob condições inflamatórias.

Estabelecendo um modelo de inflamação grave da córnea em ratos com base na curetagem do epitélio da córnea combinada com suturas da córnea

Aqui, apresentamos um protocolo para obter suspensões unicelulares de alta qualidade de córneas inteiras de camundongo por meio da digestão sequencial com colagênase A e tripsina. Esse método gera células únicas viáveis com alta integridade de RNA, tornando-as compatíveis com aplicações posteriores, como sequenciamento de RNA de célula única e citometradorde fluxo y.

Um Protocolo para Colheita de Suspensão de Célula Única de Córneas de Camundongos

Aprenda o isolamento e identificação de células de nicho limbal humanas para medicina regenerativa e restauração da visão. Este método utiliza sequenciamento de célula única e imunofluorescência.

Isolamento e Identificação de Células de Nicho Limbal

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