Name: Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Aprenda a gerar modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus laevis para estudar regeneração ocular e o papel das células gliais de Müller. Este método auxilia pesquisadores a compreender mecanismos de regeneração neural.

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Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de M.P. da Association Retina France, Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) e UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) em parceria com ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Gerando degeneração retiniana para investigar estratégias de reparo celular em Xenopus

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<li>Hamon, A., Roger, J. E., Yang, X. -J., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell-dependent+regeneration+of+the+neural+retina%3A+An+overview+across+vertebrate+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell-dependent regeneration of the neural retina: An overview across vertebrate model systems.</a> Developmental Dynamics. 245 (7), 727-738 (2016).</li>
<li>García-García, D., Locker, M., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+M%C3%BCller+glia+regenerative+potential+for+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Update on Müller glia regenerative potential for retinal repair.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 64, 52-59 (2020).</li>
<li>Todd, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+stimulation+of+retinal+regeneration+from+M%C3%BCller+glia+in+adult+mice+using+combinations+of+proneural+bHLH+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient stimulation of retinal regeneration from Müller glia in adult mice using combinations of proneural bHLH transcription factors.</a> Cell Reports. 37 (3), 109857(2021).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li>
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<li>Chesneau, A., Bronchain, O., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+chemogenetic+ablation+of+photoreceptor+cells+in+Xenopus+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Conditional chemogenetic ablation of photoreceptor cells in Xenopus retina.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 133-146 (2018).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod-specific+ablation+using+the+nitroreductase%2Fmetronidazole+system+to+investigate+regeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Rod-specific ablation using the nitroreductase/metronidazole system to investigate regeneration in Xenopus.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2018 (12), (2018).</li>
<li>Zahn, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+Table+of+Xenopus+development%3A+a+new+graphical+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Normal Table of Xenopus development: a new graphical resource.</a> Development. 149 (14), (2022).</li>
<li>McNamara, S., Wlizla, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Husbandry%2C+general+care%2C+and+transportation+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Husbandry, general care, and transportation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 1-17 (2018).</li>
<li>Parain, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+models+of+retinitis+pigmentosa+reveal+differential+proliferative+response+of+M%C3%BCller+cells+between+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated models of retinitis pigmentosa reveal differential proliferative response of Müller cells between Xenopus laevis and Xenopus tropicalis.</a> Cells. 11 (5), 807(2022).</li>
<li>Wlizla, M., McNamara, S., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+care+of+Xenopus+laevis+and+Xenopus+tropicalis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and care of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 1865, 19-32 (2018).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (27), (2009).</li>
<li>Parain, K., Chesneau, A., Locker, M., Borday, C., Perron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+from+three+cellular+sources+and+ectopic+mini-retina+formation+upon+neurotoxic+retinal+degeneration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regeneration from three cellular sources and ectopic mini-retina formation upon neurotoxic retinal degeneration in Xenopus.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Vergara, M. N., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+regeneration+in+the+Xenopus+laevis+tadpole%3A+a+new+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system.</a> Molecular Vision. 15, 1000-1013 (2009).</li>
<li>Lee, D. C., Hamm, L. M., Moritz, O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+tadpoles+can+regenerate+neural+retina+lost+after+physical+excision+but+cannot+regenerate+photoreceptors+lost+through+targeted+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis tadpoles can regenerate neural retina lost after physical excision but cannot regenerate photoreceptors lost through targeted ablation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (3), 1859-1867 (2013).</li>
<li>Martinez-De Luna, R. I., Kelly, L. E., El-Hodiri, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+homeobox+%28Rx%29+gene+is+necessary+for+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The retinal homeobox (Rx) gene is necessary for retinal regeneration.</a> Developmental Biology. 353 (1), 10-18 (2011).</li>
<li>Choi, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cone+degeneration+following+rod+ablation+in+a+reversible+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (1), 364-373 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Vantagens e desvantagens de vários paradigmas de lesão retiniana em girinos Xenopus
Lesão mecânica da retina Várias lesões cirúrgicas da retina neural foram desenvolvidas em girinos de Xenopus. A retina neural pode ser totalmente removida 15,16 ou apenas parcialmente excisada 16,17. A lesão mecânica aqui apresentada não env...

Milhões de pessoas em todo o mundo são acometidas por várias doenças degenerativas da retina que levam à cegueira, como retinose pigmentar, retinopatia diabética ou degeneração macular relacionada à idade (DMRI). Até o momento, essas condições permanecem em grande parte intratáveis. As abordagens terapêuticas atuais em avaliação incluem terapia gênica, transplantes de células ou tecidos, tratamentos neuroprotetores, optogenética e dispositivos protéticos. Outra estratégia emergente baseia-se na autorregeneração por meio da ativação de células endógenas com potencial de células-tronco. As células gliais de Müller, o principal tipo de célula glial da retina, estão entre as fontes celulares de interesse nesse contexto. Ao serem lesados, podem se desdiferenciar, proliferar e gerar neurônios 1,2,3. Embora este processo seja muito eficaz em peixes-zebra ou Xenopus, é em grande parte ineficiente em mamíferos.
No entanto, tem sido demonstrado que tratamentos adequados com proteínas mitogênicas ou superexpressão de vários fatores podem induzir a reentrada no ciclo celular da glia de Müller de mamíferos e, em alguns casos, desencadear seu subsequente comprometimento neurogênico 1,2,3,4,5. Isso permanece, no entanto, em grande parte insuficiente para os tratamentos. Assim, aumentar nosso conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração é necessário para identificar moléculas capazes de transformar eficientemente as propriedades das células-tronco de Müller em novas estratégias terapêuticas celulares.
Com esse objetivo, desenvolvemos vários paradigmas de lesão em Xenopus que desencadeiam a degeneração das células da retina. Aqui, apresentamos (1) uma lesão mecânica retiniana que não é específica do tipo celular, (2) um modelo de ablação celular condicional e reversível usando o sistema NTR-MTZ que tem como alvo as células bastonetes, (3) um knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9, um modelo de retinose pigmentar que desencadeia degeneração progressiva de células bastonetes e ( 4) uma CoCl2-modelo citotóxico induzido que, de acordo com a dose, pode visar especificamente os cones ou levar a uma degeneração celular mais ampla da retina. Destacamos as particularidades, vantagens e desvantagens de cada paradigma.

<table><tbody><tr><td>1,2-propanodiol (propil&egrave; ne glicol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398039</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto &ge; 99,8%</td> <td>de produtos químicos VWR</td><td>20821-365</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-caspase clivada 3 (coelho)</td><td>Sinalização celular</td><td>9661S</td><td>Diluição 1/300</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-GFP (frango)</td><td>Aveslabs</td><td>GFP-1020</td><td>Diluição 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-M-Opsina (coelho)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5405</td><td>Diluição 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-rato, Alexa Fluor 594 (cabra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11005</td><td>Diluição 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-Otx2 (coelho)</td><td>Abcam</td><td>Ab183951</td><td>Diluição 1/100</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho, Alexa Fluor 488 (cabra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11008</td><td>Diluição 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho, Alexa Fluor 594 (cabra)</td><td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>A11012</td><td>Diluição 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-recuperaina (coelho)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5585</td><td>Diluição 1/500</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-rodopsina (camundongo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN15</td><td>Diluição 1/1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-S-Opsina (coelho)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AB5407</td><td>Diluição 1/500</td></tr><tr><td>Kit de detecção de Apoptotis (sistema TUNEL fluorimétrico sem saída)</td><td>Promega</td><td>G3250</td><td></td></tr><tr><td>Benzocaína&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1501</td><td>Solução de estoque 10%</td></tr> <tr><td>bisBenzimida H 33258 (Hoechst)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>Solução de estoque 10 mg / mL</td></tr><tr><td>Butanol-1 &ge; 99,5%</td> <td>Produtos químicos VWR</td><td>20810,298</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl2, 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1,02382</td><td>Uso a 0,1 M</td></tr><tr><td>Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0646T</td><td></td></tr><tr><td>Clark Capillary Glass modelo GC100TF-10</td><td>Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>30-0038</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto(II) hexahidratado (CoCl2, 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td>Solução de estoque 100</td></tr><tr><td>mM Lamínula 24 x 60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Diluente Dako REAL ab&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>S202230-2</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo Rotativo Eletrônico</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 340E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Eosina 1% aquosa</td><td>RAL Diagnostics</td><td>312740</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína lisina dextrana&nbsp; &nbsp;</td>Estereomicroscópio fluorescente <td>Invitrogen Thermo Scientific</td><td>D1822</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX 200</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Euromedex</td><td>EU0410-B</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de glicerina de acordo com Mallory</td><td>Diapath</td><td>E0012</td><td>Uso a 3% em água</td></tr><tr><td>Hematoxilina (Hemalun de Mayer)</td> <td>Diagnóstico RAL</td><td>320550</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sal</td> <td>de potássioSigma-Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Hormônio gonadotrofina coriônica humana</td><td>MSD Saúde Animal</td><td>Chorulon 1500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico fumegante, 37% (HCl)</td> <td>Sigma-Aldrich (SAFC)</td> <td>1,00314</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880</td><td>Use a 2% em 0,1x MBS (pH 7,8 - 8,0)</td></tr> <tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4, 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td> <td>M3761</td><td>Use em pontas</td></tr><tr><td>de microcarregador</td> de 10 <td>mM Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de micropipeta (P-97 Flaming/Brown)</td> <td>Sutter Instrument Co.</td><td>Modelo P-97</td><td>Programa: Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Desbloqueado p = 500</td></tr><tr><td>Meio de montagem para preservar a fluorescência, FluorSave Reagent</td><td>Millipore</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem, Eukitt</td><td>Chem-Lab</td><td>CL04.0503.0500</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Ultra Lâmina de micrótomo</td><td>Epredia</td><td>3053835</td><td></td></tr><tr><td>Agulha Agani 25 G x 5/8''</td><td>Terumo</td><td>AN*2516R1</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de Pino Niquelado</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Tecido de filtração de nylon (tecido de peneiramento) NITEX, abertura de malha 1.000 &micro; m</td><td>Sefar</td><td>06-1000/44</td><td></td></tr><tr><td>Histowax de parafina sem DMSO</td><td>Histolab</td><td>00403</td><td></td></tr><tr><td>Solução de paraformaldeído (32%)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>EM-15714-S</td><td>Use a 4% em 1x PBS pH 7.4</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Descartáveis Moldes de Incorporação</td><td>Epredia</td><td>2219</td><td></td></tr><tr><td>Pilão</td><td>VWR</td><td>431-0094</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm</td><td>Placa de Petri Corning Gosselin</td><td>SB93-101</td><td></td></tr><tr><td>55 mm</td><td>Corning Gosselin</td><td>BP53-06</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Fosfato Solução Salina (PBS) 10x</td><td>Euromedex</td><td>ET330-A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Microinjeção PicoSpritzer</td> Produtos <td>de Instrumentação Parker</td><td>PicoSpritzer III</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Polissacarose (Ficoll PM 400 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4375</td><td>Use a 3% em 0.1x MBS</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Alimento para fritar em pó: sera Micron Nature</td><td>sera</td><td>45475 (00720)</td><td></td></tr><tr><td>Dissecção de tesoura</td><td>Ferramentas Fine Science</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Slide Superfrost&nbsp;</td><td>&nbsp; KNITTEL Vidro</td><td>VS11171076FKA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de lâminas</td><td>Kunz instruments</td><td>HP-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio sal trissódico di-hidratado (C6H5Na3O7, 2H2O)</td><td>VWR produtos químicos</td><td>27833.294</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich (Supelco)</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio 30% solução aquosa (NaOH)</td><td>Produtos químicos VWR</td><td>28217-292</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Seringas Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Omnifix-F Solo Seringas de uso único 1 mL</td><td>B-BRAUN</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>crRNA transativador (tracrRNA)</td><td>Tecnologias</td> <td>de DNA integradas</td><td></td>1072533</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 200DC Iluminador de Fluorescência</td><td>X-Cite&nbsp;</td><td>200DC</td><td></td></tr><tr><td>Xileno &ge; 98,5%&nbsp;</td><td>Produtos químicos da VWR</td><td>28975-325</td><td></td></tr></tbody></table>

gerando modelos de lesão retiniana em girinos xenopus

Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles

As doenças neurodegenerativas da retina são as principais causas de cegueira. Dentre as inúmeras estratégias terapêuticas exploradas, o estímulo à auto-reparação emergiu recentemente como particularmente atraente. Uma fonte celular de interesse para o reparo da retina é a célula glial de Müller, que abriga potencial de células-tronco e extraordinária capacidade regenerativa em anamniotas. Este potencial é, no entanto, muito limitado em mamíferos. O estudo dos mecanismos moleculares subjacentes à regeneração retiniana em modelos animais com capacidades regenerativas deve fornecer informações sobre como desbloquear a capacidade latente das células de Müller de mamíferos de regenerar a retina. Este é um passo fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas na medicina regenerativa. Para isso, desenvolvemos vários paradigmas de lesão retiniana em Xenopus: uma lesão retiniana mecânica, uma linha transgênica que permite a ablação condicional de fotorreceptores mediada por nitroredutase, um modelo de retinose pigmentar baseado em knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 e um modelo citotóxico conduzido por injeções intraoculares de CoCl2 . Destacando suas vantagens e desvantagens, descrevemos aqui esta série de protocolos que geram várias condições degenerativas e permitem o estudo da regeneração retiniana em Xenopus.

Lesão mecânica da retina Cortes retinianos de girinos submetidos à lesão mecânica descrita no protocolo seção 1 mostram que a lesão retiniana abrange todas as camadas do tecido enquanto permanece limitada ao local da punção (Figura 2A,B).
Ablação condicional de células bastonetes utilizando o sistema NTR-MTZ Os olhos de girinos transgênicos de Tg(rho:GFP-NTR) anestesiados tratados com MTZ, conforme ...

Desenvolvemos vários protocolos para induzir dano ou degeneração retiniana em girinos de Xenopus laevis . Esses modelos oferecem a possibilidade de estudar mecanismos de regeneração retiniana.

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

Retinal neurodegenerative diseases are the leading causes of blindness. Among numerous therapeutic strategies being explored, stimulating self-repair ...

Meu laboratório trabalha com regeneração retiniana. Estamos usando o sapo Xenopus como um sistema modelo. Este anfíbio é realmente bastante fascinante porque, ao contrário dos mamíferos, como nós, ele pode regenerar sua retina de forma muito eficiente em caso de lesão.E estamos estudando o mecanismo subjacente porque, no futuro, ele pode ser útil para desencadear a regeneração retiniana em pacientes humanos acometidos por doenças neurodegenerativas da retina. Recentemente, descobrimos que, além das células-tronco na periferia da retina e do epitélio pigmentado da retina, as células da glia também podem ser recrutadas para a regeneração da retina em caso de lesão. E por isso estamos agora a estudar as ligações entre a neuroinflamação e a capacidade regenerativa destas células.De fato, parece que o nicho neuroinflamatório é peça-chave na modulação da regeneração da retina. Para estudar os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regeneração retiniana, desenvolvemos vários paradigmas de lesão retiniana em Xenopus. A primeira é uma lesão mecânica da retina.A segunda é uma linha transgênica que permite a ablação condicional de fotorreceptores mediada por nitroredutase. O terceiro é um modelo de retinose pigmentar baseado em knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9 e, para finalizar, um modelo citotóxico conduzido por injeção intraocular de cloreto de cobalto ou CoCl2. Meu laboratório hospedeiro mostrou que, embora o Xenopus possa regenerar sua retina, a eficiência é altamente variável e depende dos estágios do girino ou da espécie, Xenopus laevis ou tropicalis.Isso faz do Xenopus um modelo fantástico para ilustrar os mecanismos moleculares que desencadeiam ou limitam a regeneração retiniana.

generating-retinal-injury-models-in-xenopus-tadpoles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

O vídeo demonstra um método para cultivar células ganglionares primárias da retina a partir de embriões de peixe-zebra. Os embriões em estágio inicial são submetidos à dissecção para isolar os olhos, que são posteriormente dissociados mecanicamente em uma suspensão de células ganglionares da retina. Esta suspensão celular é cultivada em lamínulas revestidas com proteínas adesivas para facilitar o desenvolvimento do axônio.

Geração de culturas primárias de células ganglionares da retina a partir de embriões de peixe-zebra

Este vídeo demonstra um procedimento para induzir degeneração da retina em peixes-zebra adultos usando lesão a laser. O laser tem como alvo as células fotorreceptoras da retina, desencadeando a morte celular e um processo degenerativo. Esse dano ativa as células da glia de Müller (MG), levando à sua desdiferenciação em progenitores de células-tronco que auxiliam na regeneração da retina.

Modelagem da degeneração e regeneração da retina em peixe-zebra usando uma lesão focal a laser

Vários protocolos de danos provocados pela luz têm sido descritas para fotorreceptores danos e, consequentemente, induzir uma resposta de regeneração da retina adulta em peixes-zebra. Este protocolo descreve um método melhorado, que pode ser utilizada em animais e pigmentados que danifica a grande maioria dos fotorreceptores cone e da haste ao longo de toda a retina.

A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto

Girinos de Xenopus laevis preferem nadar no lado branco de um tanque preto / branco. Este comportamento é guiado pela sua visão. Com base nesse comportamento, apresentamos um ensaio simples para testar a função visual de girinos.

Um Ensaio Comportamental simples para Teste de Função Visual em<em&gt; Xenopus laevis</em

Este protocolo descreve um método para dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura completa de embriões de galinha. As culturas de explantes são úteis quando a taxa de sucesso elevada, eficácia e reprodutibilidade são necessários para testar os efeitos de plasmídeos para a electroporação e / ou substâncias de reagentes, isto é, inibidores enzimáticos.

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

Este protocolo tem como objetivo demonstrar como microinjetar uma mistura de DNA/DOTAP em olhos de embriões de um dia de idade Xenopus laevis , e como a imagem e reconstruir a proteína fluorescente verde individual (GFP) expressando mandris axonal óptica em mesencefálicas tectal de intacto, vivendo Xenopus Tadpoles.

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

Aprenda a gerar modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus laevis para estudar regeneração ocular e o papel das células gliais de Müller. Este método auxilia pesquisadores a compreender mecanismos de regeneração neural.

Gerando modelos de lesão retiniana em girinos Xenopus

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