Name: Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-03T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprenda a criopreservar células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco embrionárias humanas no estágio ideal de crescimento. Este protocolo simples e eficiente melhora as taxas de sobrevivência celular pós-descongelamento.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81970816) para Mei Jiang; a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82201223) para Xinyue Zhu; e o Plano de Ação de Inovação em Ciência e Tecnologia da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai (2014090067000) para Haiyun Liu.

1. Dissociação celular
<ol><li>Manter as células EPR conforme descrito anteriormente 17,22. NOTA: Todas as células são cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera de 5% de CO2 durante toda a duração dos protocolos.</li>
	<li>Prepare a quantidade necessária de PBS e meio de cultura em banho-maria a 37 ° C e coloque o reagente de dissociação celular em temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte a solução de cultura e lave as placas duas vezes com 1 mL de PBS pré-aquecido por poço.</li>
	<li>Adicione 1 ml do reagente de dissociação celular às placas de 6 poços e digerir as células a 37 °C durante 15 min. Após a incubação, observe as células que encolhem e brilham nas bordas sob um microscópio para confirmar o término da digestão. NOTA: A dissociação à base de tripsina não é recomendada, pois proporciona baixa viabilidade celular.</li>
	<li>Pipete para cima e para baixo suavemente 10x com uma pipeta de 1 mL para dissociar as células e dilua a suspensão celular com meio de cultura pré-aquecido (sem Y-27632) na proporção de 1:10. Em seguida, centrifugue as células à temperatura ambiente por 3 min a 250 × g.</li>
	<li>Despeje rapidamente o sobrenadante após a centrifugação, ressuspenda suavemente o pellet celular em 2 mL do meio de cultura e ressuspenda as células 10-15x com uma pipeta.</li>
	<li>Filtrar a suspensão celular com um filtro de células de 40 μm para obter uma suspensão unicelular e calcular o número de células. NOTA: Uma suspensão unicelular é essencial para uma contagem precisa de células e densidade de semeadura celular uniforme após o descongelamento.</li>
</ol>2. Determinação do estágio celular ideal para criopreservação
NOTA: Como o estado celular varia entre os métodos de diferenciação e as linhagens celulares, a fase exponencial das células RPE cultivadas em diferentes laboratórios deve ser determinada antes do congelamento.
<ol><li>Descongelar um frasco para injetáveis de solução de matriz de membrana basal em gelo a 4 °C durante a noite. Dilua a matriz em 12 mL de DMEM/F-12 frio e misture bem. Adicione uma lamínula por alvéolo e cubra cada poço de uma placa de 24 poços com 0,25 mL da solução diluída. Incubar a placa durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C antes de utilizar e aspirar a solução de revestimento imediatamente antes de plaquear as células. NOTA: As instruções para o volume da alíquota são específicas do lote com base na concentração de proteína e são encontradas na folha de especificações do produto.</li>
	<li>Semeie as células únicas do EPR da etapa 1.7 nas lamínulas revestidas com matriz da membrana basal a uma densidade de 105 / cm2 em 1 mL de meio de cultura. Atualize o meio de cultura a cada 2-3 dias.</li>
	<li>Nos pontos de tempo indicados (1, 3, 5, 7 e 11 dias após a passagem), incube células RPE com 10 μM EdU no meio por 24 h. Fixe, permeabilize e core as células com o coquetel de reação conforme descrito no manual para detectar EdU incorporada.</li>
	<li>Capture imagens de cinco campos aleatórios sob um microscópio de fluorescência e calcule a porcentagem de células EdU-positivas. Plote as curvas de proporção-tempo positivas para EdU correspondentes para gerar uma curva de crescimento. Em seguida, determine a janela de congelamento ou a fase exponencial para cada linha celular de acordo com a curva de crescimento. NOTA: A morfologia celular hexagonal restabelecida indica que as células saem da fase exponencial.</li>
</ol>3. Criopreservação
<ol><li>Seguindo os passos 1.1 a 1.7, exceto que o tempo de digestão diminui para 5 min, centrifugue a suspensão celular à temperatura ambiente por 3 min a 250 × g.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante despejando rapidamente após a centrifugação e ressuspenda suavemente o pellet celular no meio de criopreservação a uma densidade de 2 × 106 células / mL e transfira 1 mL da suspensão celular para frascos criogênicos de 1,2 mL.</li>
	<li>Coloque imediatamente os frascos criogênicos em um recipiente de congelamento, congele a -80 ° C durante a noite para atingir uma taxa de resfriamento de -1 ° C / min e, em seguida, transfira os frascos para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>4. Descongelamento
<ol><li>Aquecer o meio de cultura num banho-maria a 37 °C e encher previamente 10 ml de meio de cultura pré-aquecido num tubo de 15 ml.</li>
	<li>Descongele rapidamente os frascos criogênicos retirados diretamente do armazenamento de nitrogênio líquido usando um sistema de descongelamento automatizado.</li>
	<li>Goteje 0,5-1 mL de meio de cultura pré-aquecido no frasco criogênico para garantir que as células congeladas se adaptem gradualmente ao novo ambiente. Em seguida, transfira 1,5-2 mL da suspensão celular para 10 mL do meio de cultura em um tubo de 15 mL e centrifugue as células a 250 × g por 3 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante despejando rapidamente após a centrifugação, ressuspenda o pellet em 2 mL de meio de cultura pré-aquecido e conte o número de células usando um hemocitômetro para determinar as taxas de recuperação e sobrevivência usando a exclusão padrão de azul de tripano (0,4% de coloração azul de tripano).</li>
	<li>Cultivar as células em superfícies revestidas com matriz da membrana basal a uma densidade de 105 células viáveis / cm2 em um meio de cultura suplementado com Y-27632 (concentração final: 10 μM). Remova o Y-27632 após 24 h.</li>
	<li>Para determinar a taxa de fixação, dissocie as células novamente e conte o número de células 24 h após o descongelamento.</li>
</ol>5. Validação da fase de congelação ideal
<ol><li>Para validar a fase de congelamento ideal determinada na etapa 2.4, descongele as células RPE congeladas em diferentes pontos de tempo e cultura por 28 dias. Colher as células para qPCR e análise de imunocoloração para avaliar a expressão de marcadores de EPR, conforme descrito anteriormente17.</li>
</ol>

Avanço do crioarmazenamento de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas

<ol><li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).</li>
<li>Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+retinal+pigment+epithelial+atrophy+in+stargardt+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthamology%22%5BJournal%5D)">Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease.</a> American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).</li>
<li>George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium%3A+Development%2C+injury+responses%2C+and+regenerative+potential+in+mammalian+and+non-mammalian+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).</li>
<li>Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+cell+transplantation%2C+biomaterials%2C+and+in+vitro+models+for+developing+next-generation+therapies+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration.</a> Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).</li>
<li>Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+as+source+for+retinal+pigment+epithelium+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).</li>
<li>Da Cruz,, L,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+1+clinical+study+of+an+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+patch+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration.</a> Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).</li>
<li>Mehat, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells+in+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration.</a> Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).</li>
<li>Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).</li>
<li>Li, Q. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+cryopreserved+clinical+grade+hESC-RPE+cells+as+a+qualified+cell+source+for+stem+cell+therapy+of+retinal+degenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases.</a> Experimental Eye Research. 202, 108305(2021).</li>
<li>Francois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunosuppressive+properties+as+a+result+of+heat-shock+response+and+impaired+interferon-gamma+licensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing.</a> Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties.</a> Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).</li>
<li>Ekpo, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+cryopreservation+evaluations+into+the+design+of+cell-based+drug+delivery+systems%3A+an+opinion+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper.</a> Frontiers in Immunology. 13, 967731(2022).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+osmolytes+in+cryopreserving+adherent+neuroblastoma+%28Neuro-2a%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells.</a> Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).</li>
<li>Okumura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+a+cryopreservation+of+cultured+human+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells.</a> PLoS One. 14 (6), e0218431(2019).</li>
<li>Pennington, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+cryopreservation+of+adherent+retinal+pigmented+epithelium+yields+viable+and+functional+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 11 (1), 6286(2021).</li>
<li>Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off+the+shelf+cellular+therapeutics%3A+Factors+to+consider+during+cryopreservation+and+storage+of+human+cells+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use.</a> Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+optimal+stage+for+cryopreservation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454(2022).</li>
<li>Leach, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium%3A+a+comparative+study+between+cell+lines+and+differentiation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+iPS+cells+in+Xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).</li>
<li>Brandl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+characterisation+of+retinal+pigment+epithelium+%28RPE%29+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28hiPSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC).</a> Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).</li>
<li>Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-+and+feeder-free+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+two+distinct+ocular+epithelial+cell+types+using+simple+modifications+of+one+method%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291(2017).</li>
<li>Foltz, L. P., Clegg, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+directed+differentiation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+human+embryonic+or+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274(2017).</li>
<li>Marcantonini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+cryoprotective+and+cytoprotective+agents+in+cryopreservation%3A+a+focus+on+melatonin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin.</a> Molecules. 27 (10), 3254(2022).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

No presente estudo, é descrito um protocolo de congelamento e descongelamento bem-sucedido para células RPE derivadas de hESC para pesquisa e necessidades clínicas. Ao contrário da linhagem celular RPE imortalizada, ARPE-19, as células RPE com fenótipo epitelial e função característicos adequados, como as células RPE derivadas de células-tronco, são mais sensíveis à criopreservação. Menos de 32% das células permaneceram 24 h após o descongelamento, se não forem adequadamente preservadas17. O tempo...

O epitélio pigmentar da retina (EPR) é uma monocamada pigmentada de células necessárias para manter o funcionamento adequado da retina1. A disfunção e a morte do EPR estão intimamente associadas a muitas doenças degenerativas da retina, incluindo degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa e doença de Stargardt 2,3. A terapia de reposição do EPR é um dos esquemas de tratamento mais promissores para essas doenças 4,5,6,7. Um suprimento estável de células RPE do doador é vital para a terapia celular. As células RPE derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESC) são uma fonte celular ideal para terapia celular porque imitam a função das células primárias de RPE e podem produzir um suprimento teoricamente ilimitado8. No entanto, o processo de diferenciação é trabalhoso e a vida útil das células RPE obtidas é relativamente curta devido à subsequente transição epitelial-mesenquimal (EMT). Portanto, a criopreservação de células RPE derivadas de hESC é uma etapa indispensável necessária para armazenamento de longo prazo e distribuição sob demanda9.
O dano celular induzido pela criopreservação pode comprometer inadvertidamente a eficácia terapêutica10,11. Portanto, estudos recentes sobre criopreservação propuseram que as condições ideais de armazenamento criogênico devem ser determinadas ao projetar terapias celulares12. A criopreservação bem-sucedida garante recuperação celular eficiente, alta viabilidade e restauração da função celular após o ciclo de congelamento e descongelamento. No entanto, estudos anteriores sobre a criopreservação das monocamadas aderentes de células de mamíferos relataram taxas de sobrevivência altamente variáveis (35%-95%) após o descongelamento 13,14,15. Muitos fatores afetam consideravelmente os resultados da criopreservação, particularmente durante o estágio de congelamento16,17. Pesquisas recentes mostraram que as células RPE congeladas em diferentes momentos exibiram recuperação variada após o descongelamento17. Até onde sabemos, faltam estudos sobre a determinação da janela de tempo de congelamento ideal para células-tronco derivadas de células-tronco. Em diferentes estudos, as células foram congeladas em vários estágios: algumas células foram congeladas logo após a passagem ou antes da confluência ou pigmentação 8,15,18, enquanto outras foram congeladas em outros momentos 9,19,20,21. Além disso, não há evidências claras de se a fase ou estágio das células RPE usadas para criopreservação afeta a função do RPE após o descongelamento. Em nosso estudo anterior, demonstramos pela primeira vez que a fase exponencial do crescimento celular (P2D5) é o melhor estágio para a criopreservação de células RPE derivadas de hESC em termos de viabilidade celular e recuperação de propriedades e funções celulares17.
O método aqui estabelecido visa criopreservar o RPE derivado de hESC em um estágio ideal para obter a melhor preservação em termos de viabilidade e função celular após o descongelamento. Usando o ensaio de marcação de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) para detectar a fase exponencial da síntese de DNA antes da criopreservação, as células RPE descongeladas exibiram viabilidade e taxa de fixação >80%, expressão gênica específica de RPE, morfologia celular polarizada, secreção de fator derivado do epitélio pigmentar, resistência transepitelial apropriada e capacidade fagocítica 8,17,22. Embora este protocolo se concentre em células RPE derivadas de hESC e nem todas as células terapêuticas sejam igualmente criopreservadas, a estratégia de congelamento na fase exponencial pode ser aplicada a muitas outras células terapêuticas.

<table><tbody><tr><td>40 &mu; filtro de células m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Kit de Proliferação de Células para Imagem, Alexa Fluor 488 Corante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de congelamento criogênico</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Biolife Solutions</td><td>07930</td><td>meio de criopreservação #1</td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>14190144</tr><tr><td>Genxin</td><td>Selcell</td><td>YB050050</td><td>meio de criopreservação #2</td></tr><tr><td>Células-tronco embrionárias humanas</td><td>fornecidas pela Wicell, EUA</td><td>Linha</td><td></td>celular H9</tr><tr><td>Matrigel, matriz qualificada por hESC</td><td>Matriz de membrana basal</td><td>de 354277 Corning</td><td></td></tr> Sistema <tr><td>de descongelamento celular automatizado ThawSTAR CFT2</td><td>BioLife Solutions</td><td>AST-601</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Solução azul 0,4%</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>TryPLE Select</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563029</td><td>reagente de dissociação de células</td></tr><tr><td>XVIVO-10 meio</td><td>Lonza</td><td>BEBP04-743Q</td><td>Meio de cultura RPE</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage

As células epiteliais pigmentares da retina (EPR) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) são fontes celulares superiores para terapia de reposição celular em indivíduos com doenças degenerativas da retina; no entanto, estudos sobre o armazenamento estável e seguro dessas células terapêuticas são escassos. A viabilidade celular altamente variável e a recuperação funcional das células RPE após a criopreservação são os problemas mais comumente encontrados. No presente protocolo, nosso objetivo foi alcançar a melhor taxa de recuperação celular após o descongelamento, selecionando a fase celular ideal para congelamento com base nas condições experimentais originais. As células foram congeladas na fase exponencial determinada usando o ensaio de marcação com 5-etinil-2'-desoxiuridina, que melhorou a viabilidade celular e a taxa de recuperação após o descongelamento. Células estáveis e funcionais foram obtidas logo após o descongelamento, independentemente de um longo processo de diferenciação. Os métodos descritos aqui permitem a preservação e descongelamento simples, eficientes e baratos de células RPE derivadas de hESC. Embora este protocolo se concentre em células RPE, essa estratégia de congelamento pode ser aplicada a muitos outros tipos de células diferenciadas.

Aqui, células RPE derivadas de hESC em P1D35 foram passadas e semeadas a uma densidade de 105 / cm2. Dentro de uma semana após a semeadura, a morfologia hexagonal característica e a pigmentação foram perdidas durante a fase de latência (aproximadamente 2 dias). As células RPE gradualmente readotaram a morfologia hexagonal na fase exponencial (aproximadamente 5 dias, Figura 1A) e entraram na fase de desaceleração (aproximadamente 6 dias) com uma morfologia mais poligonal...

Este estudo fornece um protocolo detalhado para a criopreservação eficiente de células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco humanas.

Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

Retinal pigment epithelial&#160;(RPE) cells derived from human embryonic stem cells (hESCs) are superior cell sources for cell replacement therapy in ...

Nosso laboratório visa entender melhor o mecanismo molecular das doenças da retina, com foco nas necessidades médicas não atendidas dos pacientes. Nosso objetivo é desenvolver tratamentos eficazes, como terapias baseadas em células-tronco, para eles. A criopreservação de células RPE derivadas de células-tronco é uma etapa importante para a terapia de reposição de RPE.Atualmente, as células são congeladas em vários estágios, resultando em taxas de sobrevivência altamente variáveis para descongelamento. Isso é necessário para determinar o estágio celular ideal para congelar essas células. Nosso protocolo fornece maneiras simples, eficientes e baratas de congelar células RPE, determinando a fase exponencial das células RPE para congelamento.É menos dependente de métodos diferenciados ou linhagens celulares.

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As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

Aqui apresentamos um protocolo aceito pela comunidade em formato multimídia para injeção sub-retina de um bolus de células RPE em ratos e camundongos. Essa abordagem pode ser usada para determinar potenciais de resgate, perfis de segurança e capacidades de sobrevivência de células RPE enxertadas após implantação em modelos animais de degeneração retiniana.

Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

Este protocolo descreve como produzir células epiteliais de pigmento retinal (RPE) de células-tronco pluripotentes. O método usa uma combinação de fatores de crescimento e de pequenas moléculas para direcionar a diferenciação de células-tronco em RPE imaturo em catorze dias e RPE maduro e funcional, depois de três meses.

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

Células epiteliais de pigmento retinal podem servir como uma terapia de reposição celular para a forma avançada de degeneration macular age-related seco. Este protocolo descreve a geração de um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica e o subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal embrionárias humanas células-tronco derivadas para este modelo de doença.

Subretinal transplante de células epiteliais de pigmento retinal derivado de células-tronco embrionárias humanas em um modelo de grandes olhos de atrofia geográfica

A produção de células especializadas da retina, de células-tronco pluripotentes é um ponto de viragem no desenvolvimento da terapia baseada em células-tronco para doenças da retina. O presente documento descreve um método simples para uma eficiente geração de organoids da retina e Epitélio pigmentado da retina para pesquisa básica, translacional e clínica.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

Nós descrevemos um método para engenheiro um retina tecido composto de células epiteliais de pigmento retinal derivadas de células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em cima de membrana amniótica humana e sua preparação para enxertia em modelos animais.

Engenharia de tecido de epitélio do pigmento da retina transplante-apropriado derivado de células estaminais embrionárias humanas

Este protocolo apresenta um método simples de duas etapas de diferenciação de células-tronco epiteliais estroma corneana de células-tronco pluripotentes humanas sob condições de cultura celular-free xeno - e alimentador. Os métodos de cultura celular aqui apresentados permitem a produção de custo-eficiente, em larga escala de células de qualidade clínica aplicáveis ao uso de terapia de células da córnea.

Diferenciação dirigida eficiente e escalável de clinicamente compatível Corneal estroma epiteliais células-tronco de células pluripotentes humanas

Apresentamos aqui uma técnica cirúrgica para transplante de tecido retiniano derivado de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) no espaço sub-retiniano de um modelo animal de grande porte.

Transplante Sub-Retiniano de Tecido Retiniano Derivado de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Modelo Animal de Grande Porte Felino

Descrevemos um protocolo detalhado para a preparação de células progenitoras fotorreceptoras derivadas de hESC pós-criopreservadas e a liberação sub-retiniana dessas células em camundongos rd10 .

Liberação Sub-Retiniana de Progenitores de Fotorreceptores Derivados de Células-Tronco Embrionárias Humanas em Camundongos rd10

O método descrito o isolamento e caracterização de células pulpares humanas estaminais (hDPSCs)...

Isolamento, caracterização e comparativa Diferenciação de células-tronco da polpa dentária Derivado de dentes permanentes usando dois métodos diferentes

Aprenda a criopreservar células epiteliais pigmentares da retina derivadas de células-tronco embrionárias humanas no estágio ideal de crescimento. Este protocolo simples e eficiente melhora as taxas de sobrevivência celular pós-descongelamento.

Criopreservação de células-tronco embrionárias humanas derivadas de células epiteliais pigmentares da retina no estágio ideal

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