Name: Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-06T12:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 55 s
Description: Aprenda metabolômica arteriovenosa otimizada para tecido adiposo marrom usando GC-MS em modelo murino. Este método permite estudar a troca de metabólitos mediada pelo BAT e validar achados em doenças metabólicas.

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Agradecemos a todos os membros dos laboratórios Choi e Jung pela discussão metodológica. Agradecemos a C. Jang e D. Guertin pelos conselhos e feedback. Agradecemos a M.S. Choi pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por NRF-2022R1C1C1012034 para S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 para D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 para S.M.J. e D.W.C. Este trabalho foi apoiado pela Chungnam National University for W.T.K. A Figura 1 e a Figura 2 foram criadas usando BioRender (http://biorender.com/).

Todos os experimentos foram conduzidos com a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sungkyunkwan (IACUC). Os camundongos foram alojados em um biotério aprovado pela IACUC, localizado em uma sala limpa regulada para 22 °C e 45% de umidade, após um ciclo claro/escuro diário de 12 horas. Eles foram mantidos em racks ventilados e tiveram acesso a uma dieta padrão de ração ad libitum (composta por 60% de carboidratos, 16% de proteínas e 3% de gorduras). Os materiais de cama e nidificação foram trocados semanalmente. Para este estudo, foram utilizados camundongos machos C57BL/6J com idade de 12 semanas e peso entre 25 g e 30 g. Estes animais foram provenientes de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais).
1. Modulação da atividade metabólica do tecido adiposo marrom através da aclimatação à temperatura e estimulação farmacológica
NOTA: A aclimatação da temperatura ao longo de vários dias a semanas ou a estimulação farmacológica usando agonistas dos receptores β-adrenérgicos são métodos comumente empregados para modular a atividade da MTD1. Portanto, uma visão geral concisa do método é fornecida abaixo para permitir que os leitores escolham a abordagem apropriada, conforme necessário. Para obter MTD metabolicamente inativa (menos termogênica), uma temperatura quente basal, conhecida como termoneutralidade (28-30 °C), é selecionada para camundongos C57BL/6J. Essa faixa garante que os camundongos não precisem gastar energia extra para manter uma temperatura corporal constante. Para obter MTD metabolicamente modesta ou altamente ativa (termogênica), temperaturas de frio leve (20-22 °C) ou frio severo (6 °C) podem ser escolhidas, respectivamente. Para os propósitos deste experimento, camundongos foram criados em condições padrão de alojamento a 22 °C, que, embora levemente frias para camundongos, não envolveram nenhum estímulo farmacológico.
<ol><li>Aclimatação de temperatura<ol><li>Separe os ratos para abrigar 1 ou 2 camundongos por gaiola pelo menos 1 semana antes de iniciar a aclimatação da temperatura. Prepare incubadoras de roedores equipadas com ventilação de ar, temperatura e controle de umidade com as condições desejadas.</li>
		<li>Mover as gaiolas para suas respectivas incubadoras de roedores em dias apropriados para o tipo de aclimatação de temperatura escolhido.</li>
		<li>Certifique-se de que a distribuição do número de ratos seja uniforme em todos os grupos, com 1 ou 2 ratos por gaiola. A habitação individual é preferida por ser mais sensível às mudanças fisiológicas induzidas pela temperatura em comparação com a habitação de grupo43. Aqui estão as condições específicas de moradia para cada grupo:<ol><li>Grupo de termoneutralidade (30 °C): Manter os ratos deste grupo continuamente a uma temperatura de 30 °C durante até quatro semanas.</li>
			<li>Grupo de frio severo: Inicialmente, abrigar os camundongos deste grupo a 18 °C sem nenhum material de nidificação. Eles experimentarão uma diminuição semanal gradual da temperatura, chegando a 6 °C na quarta semana. A progressão da temperatura é a seguinte: 18 °C → 14 °C → 10 °C → 6 °C.</li>
			<li>Grupo de frio moderado (20-22 °C): Alojar os ratos deste grupo em incubadoras de roedores nas mesmas condições de alojamento padrão mencionadas anteriormente.</li>
			<li>Desafios de frio agudo: Para desafios de frio agudo, coloque 1-2 camundongos por gaiola sem nenhum material de nidificação e os exponha a uma incubadora de roedores fixada a 6 °C por até 8 h. NOTA: Estas condições de alojamento e variações de temperatura são essenciais para estudar os efeitos de diferentes ambientes de temperatura na atividade e metabolismo de MTD.</li>
		</ol></li>
		<li>Troque as gaiolas e reponha comida e água toda semana. Pré-aclimatar as gaiolas pelo menos 24 h antes da suplementação, em sua respectiva temperatura (incubadora de roedores). NOTA: Para evitar a perturbação do estímulo de temperatura apropriado, é importante não fornecer enriquecimento de ratos que possam levar à construção de ninhos. Em resposta ao frio intenso, os ratos gastam mais energia para manter a temperatura corporal, resultando em aumento da ingestão de alimentos e maiores taxas de excreção. Portanto, é crucial verificar as gaiolas pelo menos duas a três vezes por semana (seguindo as diretrizes institucionais locais) para garantir que os camundongos tenham um suprimento adequado de comida e água, e que as gaiolas não estejam excessivamente úmidas. Esse monitoramento é essencial para manter o bem-estar e a saúde dos camundongos durante o estudo.</li>
	</ol></li>
	<li>Estimulação farmacológica1 utilizando o agonista dos receptores β3-adrenérgicos CL316,243<ol><li>Para maximizar o efeito estimulatório, pré-alojar os ratos em termoneutralidade (30 °C) por 2-4 semanas antes das injeções.</li>
		<li>Após o período de aclimatação, injetar por via intraperitoneal 1 mg/kg CL316,243. NOTA: Para estimulação crônica com o agonista do receptor β3-adrenérgico (por exemplo, de 3 dias até semanas 1,44,45), injeções diárias são necessárias devido à estabilidade da droga. CL316,243 diluído deve ser preparado no dia da injeção devido à estabilidade.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coleta de sangue arteriovenoso
NOTA: Camundongos com mais de 12-14 semanas são mais recomendados para amostragem de sangue arteriovenoso. Camundongos mais jovens podem não ter veias de Sulzer suficientemente dimensionadas, um vaso sanguíneo distinto que drena especificamente o sangue venoso da MTDinterescapular 46.
<ol><li>Anestesiar suavemente com vaporizador calibrado com isoflurano a 3% para indução (em câmara de 205 x 265 x 200 mm) e isoflurano a 2% para manutenção (com máscara de anestesia gasosa). NOTA: Todo o procedimento de coleta de sangue arteriovenoso deve ser prontamente realizado após a anestesia. Uma almofada de aquecimento aquecida por água pode ser usada durante a anestesia para manter a temperatura corporal central. CUIDADO: O isoflurano é altamente volátil e tóxico quando inalado. Portanto, a anestesia primária deve ser realizada sob uma capela de fumaça.</li>
	<li>Verifique os reflexos do animal, como a retração da pata, para confirmar se a anestesia atingiu uma profundidade adequada.</li>
	<li>Coleta de sangue venoso da veia da Sulzer<ol><li>Posicione o mouse para expor a pele dorsal, confirme a profundidade da anestesia através de uma pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Umedeça a pele dorsal com amplo etanol a 70% para evitar o descolamento de cabelo e faça uma incisão ao longo das costas da parte inferior do tórax até o pescoço. NOTA: A MTD interescapular está localizada logo abaixo da pele, consistindo de duas almofadas de gordura cobertas por finos tecidos adiposos brancos. É importante garantir que o rato permaneça sob anestesia através da máscara de anestesia gasosa.</li>
		<li>Levante suavemente a MTD interescapular com pinças de ponta dobrada e corte cuidadosamente os tecidos anexados, a maioria dos quais são músculos. Levante o coxim gorduroso em direção à cabeça, continue a cortar os tecidos anexados e abra cuidadosamente a região até que a veia de Sulzer (um grande vaso vermelho escuro em forma de 'Y' conectado a ambos os coxins de gordura do morcego interescapular) seja exposta. NOTA: Tenha cuidado para não cortar os vasos capilares dos tecidos musculares que estão conectados com a região frontal e lateral do BAT interescapular, pois isso reduzirá significativamente a quantidade e a qualidade do sangue que drena da veia de Sulzer.</li>
		<li>Corte cuidadosamente a veia da Sulzer e colete aproximadamente 40 μL de sangue usando pontas de pipeta de 200 μL cortadas no fundo e uma pipeta P100. Armazenar o sangue em um tubo de coleta de sangue e manter o tubo no gelo até o processo de coleta de soro. NOTA: É importante coletar sangue logo abaixo do ponto de divisão em forma de Y da veia de Sulzer, para evitar a contaminação do sangue da veia cava superior47. Coletar muito sangue diminuirá as características da veia de Sulzer. Assim, certifique-se de coletar a quantidade mínima de sangue necessária da veia da Sulzer para análise. Seja cuidadoso ao selecionar tubos de coleta de sangue, pois soro e plasma produzem diferentes perfis de metabólitos 48,49,50. Para a coleta de plasma, é necessário o uso de tubos revestidos com heparina. Neste experimento, tubos revestidos com ativador de coagulação foram escolhidos para obtenção de soro. Em nenhuma circunstância devem ser utilizados tubos revestidos com EDTA, pois o EDTA impacta significativamente os sinais de espectrometria de massa51,52.</li>
	</ol></li>
	<li>Coleta de sangue arterial do ventrículo esquerdo<ol><li>Vire o mouse sem perder o contato com o cone do nariz, para expor a pele ventral. Confirme a profundidade da anestesia através de uma pinça do dedo do pé antes de fazer a incisão. Umedeça a pele ventral com ampla quantidade de etanol a 70% para evitar o descolamento de cabelos e abra cuidadosamente a cavidade torácica com tesoura para expor o coração sem danificar nenhuma estrutura interna.</li>
		<li>Puncione com precisão a área do ápice do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 29 G (1/2"). Inserir dois terços de uma agulha de 1/2'' a 3-5 mm na horizontal direita do ápice do coração (Figura 1B) e puxar a seringa para trás para coletar sangue do ventrículo esquerdo (50-100 μL). O sangue do ventrículo esquerdo é sangue arterial oxigenado, que é vermelho vivo. Armazenar o sangue em um tubo de coleta de sangue e manter o tubo no gelo até o processo de coleta de soro. NOTA: Uma incisão mínima deve ser feita na cavidade torácica para acesso ao coração. A incisão excessiva pode levar a sangramento local, que posteriormente pode resultar em pressão arterial baixa. Isso poderia afetar a qualidade do sangue arterial coletado do ventrículo esquerdo. Evite girar ou virar o coração, pois isso dificultará a determinação da posição precisa do ventrículo esquerdo.</li>
		<li>Realizar a eutanásia e garanti-la com um método adequado seguindo as orientações das instituições locais. Por exemplo, a eutanásia pode ser realizada através do deslocamento cervical e confirmada pela cessação dos batimentos cardíacos.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugar amostras de sangue a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recolha cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma pipeta. O sobrenadante deve conter soro ou plasma, dependendo do tipo de tubo de coleta de sangue usado. Pode-se parar aqui e armazenar as amostras a -20 °C até o processamento do soro para análise de CG-EM. NOTA: A hemólise pode potencialmente ter ocorrido se o sobrenadante de cor vermelha for observado. Para evitar hemólise, vórtice a amostra antes que a coagulação seja concluída. Alguns metabólitos enriquecidos com hemácias, incluindo glutamina e lactato, podem levar a erros de interpretação dos dados, embora a maioria dos metabólitos possa não ser significativamente afetada pela hemólise. Recomenda-se analisar o soro/plasma dentro de uma semana.</li>
</ol>3. Extração de metabólitos do soro e derivatização química
<ol><li>Preparação para a extração NOTA: Todos os métodos, incluindo extração de metabólitos, derivatização e análise de dados, são versões ligeiramente modificadas dos métodos descritos anteriormente53,54.<ol><li>Preparar o tampão de extracção adicionando 100 μM de solução de DL-norvalina, padrão interno (ver Tabela de Materiais), ao metanol de grau MS.</li>
		<li>Garantir que todos os procedimentos experimentais sejam conduzidos no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfira 10 μL de soro de camundongos extraído da veia de Sulzer ou do ventrículo esquerdo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 40 μL de tampão de extração.</li>
	<li>Para remover restos celulares e proteínas, agite brevemente as amostras de soro, seguido da centrifugação à velocidade máxima (18.000 x g) por 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Após centrifugação, transferir cuidadosamente 40 μL de sobrenadante para um frasco para injetáveis de vidro, seguido de 3 h de secagem numa centrífuga a vácuo a 4 °C. NOTA: Recomenda-se uma pastilha de vidro (consulte a Tabela de Materiais) em vez de tubos de plástico devido a produtos químicos reativos de plástico usados durante toda a etapa de derivatização subsequente.</li>
	<li>Submeter as amostras secas a duas etapas consecutivas de derivatização para a análise GC-MS dos metabólitos séricos. NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas sob um exaustor devido aos riscos de irritação dos solventes.<ol><li>Ressuspender os extractos de soro secos em 30 μL de cloridrato de metoxiamina 10 mg/ml (ver Tabela de Materiais) dissolvido em piridina e incubá-lo a 37 °C durante 30 minutos.</li>
		<li>Derivatizar amostras para sililação de metabolitos com 70 μL de N-metil-N-terc-butildimetilsililifluoroacetamida (MTBSTFA, ver Tabela de Materiais) a 70 °C durante 1 h. NOTA: O uso de uma seringa de vidro é recomendado em vez de uma ponta de plástico nas etapas a seguir devido aos solventes de derivatização que reagem com o plástico.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Análise metabolômica por CG-EM
NOTA: O GC-EM quádruplo único (ver Tabela de Materiais) foi empregado para medir os vários metabólitos séricos, incluindo carboidratos, aminoácidos e intermediários do ciclo do TCA em amostras derivatizadas da veia de Sulzer e do ventrículo esquerdo. Outras colunas podem ser usadas alternativamente, embora as configurações experimentais, incluindo o programa de temperatura, possam variar dependendo dos tipos de colunas usadas.
<ol><li>Injetar 1 μL da amostra derivatizada no CG em modo splitless a 280 °C (temperatura de entrada), usando hélio como gás carreador com vazão de 1.500 mL/min (set point).</li>
	<li>Ajuste o quadrupolo a 200 °C com interface GC-MS a 300 °C. NOTA: O programa do forno para todas as análises de metabólitos começa em 60 °C, é mantido por 1 minuto e, em seguida, é aumentado a uma taxa de 10 °C/min até que a temperatura atinja 320 °C.</li>
	<li>Coletar dados por ionização de elétrons (EI) ajustada em 70 eV e adquirir os dados da amostra no modo de varredura (50-550 m/z)53. Todos os metabólitos utilizados neste estudo foram previamente validados com padrões para confirmar espectros de massa e tempos de retenção.</li>
	<li>Realizar a integração da área de pico usando um software de análise disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Combine os compostos com o íon produto de cada derivado TBMDS. Em seguida, obtenha o cromatograma de íons de extração (EIC) integrando o valor m/z do íon fragmento na área do pico correspondente e, em seguida, exporte-o. Os íons fragmentados são mostrados na Tabela 1. NOTA: A CEI de cada composto foi normalizada pela DL-norvalina em cada amostra. Os dados são representados pela veia Log2 de Sulzer para o ventrículo esquerdo (Log2(SV/LV)) usando cada valor normalizado de EIC.</li>
</ol>

Explorando a troca de metabólitos no tecido adiposo marrom

Os autores declaram não haver conflitos de interesse a declarar.

Um passo crítico na compreensão do potencial metabólico da MTD no balanço energético de todo o corpo é definir quais nutrientes ela consome, como eles são processados metabolicamente e quais metabólitos são liberados na circulação. Esse protocolo introduz uma técnica especializada em amostragem arteriovenosa que permite o acesso à vasculatura venosa das MTD interescapulares e da vasculatura arterial sistêmica em camundongos C57BL/6J, recentemente desenvolvida e validada por Park ecols.42. Abaixo e...

O tecido adiposo marrom (BAT) possui uma propriedade única de gasto energético conhecida como termogênese sem tremores (NST), que envolve mecanismos dependentes da proteína desacopladora mitocondrial 1 (UCP1) e independentes de UCP1 1,2,3,4,5. Essas características distintas implicam MTD na regulação do metabolismo sistêmico e na patogênese de doenças metabólicas, incluindo obesidade, diabetes tipo 2, doença cardiovascular e caquexia por câncer 6,7,8. Estudos retrospectivos recentes têm demonstrado associação inversa entre massa de MTD e/ou sua atividade metabólica com obesidade, hiperglicemia e saúde cardiometabólica em humanos 9,10,11.
Recentemente, a MTD tem sido proposta como um sumidouro metabólico responsável pela manutenção do NST, uma vez que requer quantidades substanciais de nutrientes circulantes como combustível termogênico 6,7. Além disso, as MTD podem gerar e liberar fatores bioativos, denominados adipocinas marrons ou BATokines, que atuam como sinais endócrinos e/ou parácrinos, indicando seu envolvimento ativo na homeostase metabólica em nível de sistemas 12,13,14,15. Portanto, a compreensão do metabolismo de nutrientes da MTD deve melhorar nossa compreensão de seu significado fisiopatológico em humanos, além de seu papel convencional como órgão termorregulador.
Estudos metabolômicos empregando traçadores de isótopos estáveis, em combinação com estudos clássicos de absorção de nutrientes usando radiotraçadores não metabolizáveis, melhoraram significativamente nossa compreensão de quais nutrientes são preferencialmente absorvidos pela MTD e como são utilizados 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Por exemplo, estudos com traçadores radioativos demonstraram que a MTD ativada pelo frio absorve glicose, ácidos graxos ligados a lipoproteínas e aminoácidos de cadeia ramificada 16,17,18,19,20,21,22,23,27 . O recente rastreamento isotópico combinado com estudos metabolômicos tem permitido medir o destino metabólico e o fluxo desses nutrientes dentro dos tecidos e células cultivadas 24,25,26,28,29,30. No entanto, essas análises se concentram principalmente na utilização individual de nutrientes, deixando-nos com conhecimento limitado dos papéis de nível de sistemas da MTD na troca de metabólitos de órgãos. As questões relativas às séries específicas de nutrientes circulantes consumidos pelas MTD e às suas contribuições quantitativas em termos de carbono e azoto permanecem indefinidas. Além disso, a exploração de se a MTD pode gerar e liberar BATokines derivadas de metabólitos (por exemplo, lipocinas) usando nutrientes está apenas começando 12,13,14,15,31,32.
A análise arteriovenosa do sangue é uma abordagem fisiológica clássica utilizada para avaliar a captação ou liberação específica de moléculas circulantes em órgãos/tecidos. Esta técnica já foi aplicada à MTD interescapular de ratos para medir oxigênio e vários metabólitos, estabelecendo a MTD como o principal sítio de termogênese adaptativa com seu potencial catabólico 33,34,35,36,37. Recentemente, um estudo arteriovenoso utilizando MTD interescapular de ratos foi acoplado a uma abordagem trans-ômica, levando à identificação de BATokinas não descobertas liberadas por MTD estimulada termogenicamente38.
Avanços recentes em cromatografia gasosa de alta sensibilidade e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (GC-MS e LC-MS) têm reacendido o interesse em estudos arteriovenosos para a análise quantitativa da troca de metabólitos órgão-específicos 39,40,41. Essas técnicas, com seu alto poder de resolução e precisão de massa, permitem a análise abrangente de uma ampla gama de metabólitos usando pequenas quantidades de amostra.
Em alinhamento com esses avanços, um estudo recente adaptou com sucesso a metabolômica arteriovenosa para o estudo da MTD em camundongos, possibilitando a análise quantitativa das atividades de troca de metabólitos nas MTD em diferentes condições42. Este artigo apresenta um protocolo de metabolômica arteriovenosa direcionado para MTD usando GC-MS em um modelo de camundongo C57BL/6J.

<table><tbody><tr><td>0,5-20 &micro; L Pontas de Filtro</td><td>Axygen</td><td>AX. TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 mL com agulha acoplada - 26 G 5/8"</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 5977B GC/MSD (detector seletivo de massa)</td><td>Agilent</td><td>G7077B</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 7693A Amostrador automático</td><td>Agilent</td><td>G4513A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 8890 GC System</td><td>Agilent</td><td>G3542A</td><td></td></tr><tr><td>Agilent J& W Coluna GC (Coluna Capilar) HP-5MS UI</td><td>Agilent</td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>Agilent MassHunter Workstation software_MS Análise quantitativa (Quant-My-way)</td> <td>Agilent</td><td>G3335-90240</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J mouse</td><td>DBL</td><td>C57BL / 6JBomTac</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -50 &deg; C Armadilha Fria (com Tampa de Aço Inoxidável)</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td>7811041</tr><tr><td>DL-Norvaline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7502-25G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000210</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Inserção de vidro 250 &mu; L&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5181-1270</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (grau LC-MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Q34966-1L</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de metoxiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>226904-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microvette&nbsp; 200 Sérum, 200 &micro; L, tampa vermelha, base plana</td><td>Sarstedt</td><td>20.1290.100</td><td></td></tr><tr><td>MTBSTFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>394882-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Piridina(anidra, 99,8%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270970-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores de Vácuo Completos CentriVap Refrigerados</td><td>LABCONCO&nbsp;</td><td></td><td></td>7310041</tr><tr><td>Dieta para roedores</td><td>SAFE</td><td>SAFE R+40-10</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de roedores</td><td>Power scientific</td><td>RIT33SD</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de caneta ultrafinas - 29 G 1/2"</td><td>BD Biosciences</td><td>328203</td> Tampa do frasco 9 <td></td></tr><tr><td>mm</td><td>Agilent</td><td>5190-9067</td><td></td></tr><tr><td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL</td><td>Agilent</td><td>5190-9063</td><td></td></tr><tr><td>Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolômica arteriovenosa para mensuração da troca de metabólitos in vivo no tecido adiposo marrom

Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue

O tecido adiposo marrom (BAT) desempenha um papel crucial na regulação da homeostase metabólica através de um processo único de gasto energético conhecido como termogênese sem tremores. Para conseguir isso, a BAT utiliza um cardápio diversificado de nutrientes circulantes para suportar sua alta demanda metabólica. Além disso, a MTD secreta fatores bioativos derivados de metabólitos que podem servir como combustíveis metabólicos ou moléculas sinalizadoras, facilitando a comunicação intratecidual e/ou intertecidual mediada por BAT. Isso sugere que a MTD participa ativamente na troca de metabólitos sistêmicos, uma característica interessante que está começando a ser explorada. Aqui, apresentamos um protocolo para metbolômica arteriovenosa BAT otimizada em nível de camundongo in vivo . O protocolo se concentra em métodos relevantes para estimulações termogênicas e uma técnica de coleta de sangue arteriovenoso usando a veia de Sulzer, que drena seletivamente o sangue venoso interescapular derivado do BAT e o sangue arterial sistêmico. Em seguida, um protocolo metabolômico baseado em cromatografia gasosa usando essas amostras de sangue é demonstrado. O uso desta técnica deve expandir a compreensão da troca de metabólitos regulados por MTD em nível inter-órgão, medindo a captação líquida e liberação de metabólitos por BAT.

A Figura 1 ilustra o esquema experimental da metabolômica AV otimizada para BAT. Como mencionado na seção Protocolo, para obter tecido adiposo marrom diferencialmente estimulado, camundongos são submetidos à aclimatação à temperatura em incubadoras de roedores ou recebem administração farmacológica, como agonistas de receptores β-adrenérgicos. Posteriormente, camundongos são anestesiados e amostras de sangue são coletadas para análise metabolômica (Figura 1A). P...

Neste protocolo, métodos relevantes para metabolômica arteriovenosa otimizada para BAT usando GC-MS em um modelo de camundongo são descritos. Esses métodos permitem a aquisição de informações valiosas sobre a troca de metabólitos mediada por MTD em nível de organismo.

Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

Brown adipose tissue (BAT) plays a crucial role in regulating metabolic homeostasis through a unique energy expenditure process known as non-shivering ...

Nosso laboratório está interessado em identificar mecanismos pelos quais vias de sinalização e vias metabólicas colaboram para regular o metabolismo e a fisiologia do tecido adiposo. E através dessa abordagem, pretendemos encontrar uma maneira de prevenir ou combater doenças metabólicas causadas por desequilíbrios energéticos, como obesidade e diabetes. A principal vantagem do nosso protocolo é que mudamos do modelo convencional de ratos para o uso de um modelo de camundongo para coleta de sangue venoso arterial e análise metabolômica.Acreditamos que essa transição nos permitirá validar nossos achados usando os modelos genéticos padrão-ouro mais rapidamente para a pesquisa de gordura marrom.

arteriovenous-metabolomics-to-measure-vivo-metabolite-exchange-brown

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

O método aqui apresentado utiliza 18 F-Fluorodeoxyglucose (18 F-FDG) tomografia por emissão de pósitrons / tomografia computadorizada (PET-CT) e água gordura separada ressonância magnética (MRI), cada digitalizada seguinte 2 exposição hr para termoneutro (24 ° C ) e condições de frio (17 ° C), a fim de mapear tecido adiposo castanho (BAT) em seres humanos adultos.

Brown Human Tissue adiposo Depots automaticamente segmentada por Positron Emission Tomography / Tomografia Computadorizada e registrado ressonância magnética

Utilizando software livre, open-source, desenvolvemos uma abordagem analítica para quantificar o volume total e regional adiposo tecido marrom (BAT) e a atividade metabólica de morcego usando 18F-FDG PET/CT.

Todo o corpo e quantificação Regional de ativo humano marrom tecido adiposo usando 18F-FDG PET-CT

Esta técnica descreve a gravação em tempo real do consumo de oxigênio e taxas de acidificação do extracelular nos tecidos da retina explantados rato, usando um analisador de fluxo extracelular.

Medição do metabolismo energético, no tecido da retina explantado, usando análise de fluxo extracelular

Imagem funcional e quantitação de depósitos de adiposos termogênicos em camundongos usando uma abordagem baseada em imagens micro-PET/MR.

Visualização e Quantificação de Tecidos Adiposos Marrons e Bege em Camundongos usando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Este manuscrito descreve um protocolo para medir a taxa metabólica basal e a capacidade oxidativa de adipócitos termogênicos em camundongos obesos.

Determinando o gasto energético basal e a capacidade de adipócitos termogênicos para gastar energia em camundongos obesos

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar o significado fisiológico do impacto da atividade do tecido adiposo marrom (BAT) no metabolismo humano. Isto é conseguido combinando carga de carboidratos e calorimetria indireta com medidas de mudanças supraclaviculares de temperatura. Esta nova abordagem pode ajudar a desenvolver um alvo farmacológico para a termogênese BAT em humanos.

Usando uma combinação de calorimetria indireta, termografia infravermelha e níveis de glicose no sangue para medir a termogênese do tecido adiposo marrom em humanos

Aqui, descrevemos um protocolo para isolar, cultivar e fenotipar células endoteliais microvasculares do tecido adiposo subcutâneo humano (hSATMVECs). Além disso, descrevemos um modelo experimental de diafonia hSATMVEC-adipócitos.

Estudando a conversa cruzada de células endoteliais adiposas/adipócitos no tecido adiposo subcutâneo humano

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

O objetivo do protocolo é preparar o hidrolisado de queratina de penas de galinha por hidrólise alcalina-enzimática e testar se adicionando hidrolisado de queratina em uma base de pomada de cosméticos melhora a função de barreira da pele (aumentando a hidratação e diminuindo a perda de água transepidermal). Os testes são realizados em homens e mulheres voluntários.

Preparação de hidrolisado de queratina de penas de galinha e sua aplicação em cosméticos

Aprenda metabolômica arteriovenosa otimizada para tecido adiposo marrom usando GC-MS em modelo murino. Este método permite estudar a troca de metabólitos mediada pelo BAT e validar achados em doenças metabólicas.

Metabolômica Arteriovenosa para Mensuração da Troca de Metabólitos In Vivo no Tecido Adiposo Marrom

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