Name: Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprenda cinco paradigmas comportamentais em Drosophila para avaliar transtorno do espectro autista, incluindo agressão, espaçamento social, cortejo, higienização e habituação. Esses métodos padronizados permitem quantificar déficits comportamentais ligados ao TEA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Somos imensamente gratos a Mani Ramaswami (NCBS, Bangalore) e Baskar Bakthavachalu (IIT Mandi) pela configuração do ensaio de habituação e escolha de odor, Pavan Agrawal (MAHE) por suas valiosas sugestões sobre o ensaio de agressão, Amitava Majumdar (NCCS, Pune) por compartilhar seu protótipo de câmara de ensaio de namoro e linhas de mosca mutante Fmr1 , e Gaurav Das (NCCS, Pune) por compartilhar a linha MB247-GAL4. Agradecemos ao Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, Indiana, EUA), ao Instituto Nacional de Genética (NIG, Kyoto, Japão), à Banaras Hindu University (BHU, Varanasi, Índia) e ao Centro Nacional de Ciências Biológicas (NCBS, Bangalore, Índia) pelas linhas de Drosophila . O trabalho no laboratório foi apoiado por doações do SERB-DST (ECR / 2017 / 002963) para AD, bolsa DBT Ramalingaswami concedida ao AD (BT / RLF / Re-entry / 11/2016) e apoio institucional do IIT Kharagpur, Índia. SD e SM recebem Ph.D. bolsas de estudo do CSIR-Senior Research Fellowship; PM recebe um Ph.D. bolsa de estudos do MHRD, Índia.

Drosófila Modelos para traços genéticos e comportamentais do transtorno do espectro do autismo

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

A Drosophila é usada como um organismo modelo fino para pesquisa em distúrbios neurológicos humanos devido a um alto grau de conservação de sequências gênicas entre genes de moscas e doenças humanas9. Numerosos paradigmas comportamentais robustos o tornam um modelo atraente para estudar fenótipos manifestados em mutantes que recapitulam doenças humanas. Como centenas de genes estão implicados no transtorno do espectro do autismo (TEA), não existe um modelo comum de TEA em nenhum organismo modelo. Portanto, para cada mutante, os pesquisadores devem primeiro estabelecer fenótipos semelhantes ao TEA na mosca. Neste artigo, tentamos agilizar o processo, propondo o uso de cinco paradigmas comportamentais de moscas em conjunto para tal avaliação. Esses paradigmas são empregados em moscas para avaliar déficits comportamentais importantes e comuns de pacientes humanos com TEA: déficits sociais e de comunicação, aprimoramento de comportamentos repetitivos e defeito de habituação. Se uma mutação no gene da mosca mostrar defeitos em todos ou na maioria desses cinco paradigmas, pode ser uma forte indicação de um cenário semelhante ao TEA.
A maioria dos paradigmas comportamentais descritos aqui foi usada várias vezes na literatura anterior para resolver diversas questões de pesquisa. Não é incomum encontrar variações nas técnicas entre os diferentes estudos. Os ajustes nas técnicas foram feitos para atender à necessidade de pesquisa e atender à demanda da questão específica que está sendo resolvida. Por exemplo, no ensaio de namoro, o comportamento de namoro inato e aprendido pode ser quantificado em relação a uma mosca testadora que pode ser um macho imaturo65, uma fêmea virgem66,67, uma fêmea pré-acasalada 68,69,70, uma fêmea virgem morta por congelamento65, ou mesmo uma fêmea decapitada19. No método descrito neste artigo, fêmeas pré-acasaladas do tipo selvagem foram usadas como testadores para verificar o padrão de namoro de uma mosca modelo ASD macho. A receptividade sexual deuma fêmea pré-acasalada é relativamente menor do que a de uma mosca virgem71. Como resultado, o número de ataques de namoro masculino e sua duração são mais para uma fêmea acasalada do que para uma virgem; Da mesma forma, a latência para a cópula também é maior do que a das fêmeas testadoras virgens, caso em que a cópula precoce leva à redução do índice de namoro, reduzindo o escopo para uma comparação eficaz entre os genótipos. Portanto, o uso de fêmeas pré-acasaladas como testador fornece uma melhor análise comparativa do comportamento de corte de uma mosca ASD versus uma mosca do tipo selvagem. Por outro lado, o uso de fêmeas virgens pode fornecer informações adicionais que podem ser mascaradas quando fêmeas acasaladas são usadas. O uso de fêmeas acasaladas também pode influenciar e alterar o comportamento de namoro masculino. Em suma, sugere-se que os pesquisadores escolham sua estratégia experimental e detalhes dependendo da necessidade do experimento específico.
É preciso ser cauteloso aqui antes de aplicar a técnica em qualquer ou todos os homólogos de genes ASD de moscas. Todos esses paradigmas comportamentais são regulados por um número específico e pequeno de neurônios. A expressão de um determinado gene deve ser estabelecida antes de prosseguir para um paradigma comportamental específico. Por exemplo, se o homólogo da mosca de um gene associado ao TEA não for expresso em neurônios do corpo do cogumelo ou neurônios glutamatérgicos, o comportamento de namoro e higiene pode não ser afetado em seu mutante.
Outro ponto que os pesquisadores precisam ter cuidado é que a falta de um defeito nem sempre significa que a mutação não tem papel. Por exemplo, nos experimentos de comportamento de aliciamento com mutantes Fmr1 , a contagem total de aliciamento não é significativamente menor em mutantes do que em controles, enquanto outros parâmetros, como índice de aliciamento, etc., demonstram um defeito no comportamento de aliciamento. Isso pode ser explicado pelo prolongamento de cada sessão de preparação em mutantes Fmr1 , resultando em uma contagem baixa do número total de lutas, apesar da duração total da sessão ser muito maior. Isso enfatiza a necessidade de quantificação de múltiplos parâmetros para cada padrão comportamental. Além disso, deve-se lembrar que o termo TEA abrange uma ampla gama de doenças causadas por variações em qualquer uma das centenas de genes, resultando em fenótipos heterogêneos com vários graus de penetrância entre os indivíduos afetados. Por exemplo, o déficit de habituação é observado em alguns pacientes, mas não em todos. O mesmo seria esperado em modelos de moscas da doença.
Para a análise do comportamento agressivo, diferentes tipos de parâmetros agressivos foram levados em consideração neste estudo: lunging, wing threat, tussling, etc. (Figura 1)30. Cada luta precisa ser identificada e contada como um tipo de luta individual ou como uma contagem total de lutas. É importante primeiro conhecer os padrões de agressão das moscas machos, descritos em59,72 e mostrados na Figura 1. Ao contar os números de lutas agressivas, os pontos inicial e final de um único evento de agressão precisam ser claramente identificados; Vários tipos de padrões de agressão podem ser mostrados em uma única luta, seguida pelo final da luta. Um ataque de agressão é considerado encerrado quando uma mosca para de mostrar qualquer um dos comportamentos ou movimentos agressivos por 2 s ou interrompe o ataque e começa a se afastar.
A maioria desses paradigmas comportamentais tem múltiplas variações e avanços descritos por vários laboratórios. Cada uma das modificações específicas foi criada para atender às necessidades de um propósito específico. Da mesma forma, técnicas de quantificação ou análise automatizadas e baseadas em algoritmos liberaram essas técnicas das chances de erros manuais. Neste artigo, as técnicas mais básicas foram demonstradas com a menor quantidade de requisitos materiais, na esperança de que essas técnicas possam ser facilmente adotadas e utilizadas pelo maior número possível de pesquisadores.

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de distúrbios neurológicos. Inclui uma série de distúrbios complexos do neurodesenvolvimento caracterizados por déficits multicontextuais e persistentes na comunicação social e interação social e a presença de padrões e interesses comportamentais e de atividade restritos e repetitivos1. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), 1 em cada 100 crianças é diagnosticada com TEA em todo o mundo, com uma proporção de homens para mulheres de 4,22. A doença torna-se evidente no segundo ou terceiro ano de vida. Crianças com TEA mostram falta de interesse em reciprocidade socioemocional, comunicação não verbal e habilidades de relacionamento. Eles exibem comportamentos repetitivos, como movimento motor estereotipado, rotina inflexível e ritualizada e foco intenso em interesses restritos. Crianças com TEA apresentam um alto grau de resposta ao toque, olfato, som e paladar, enquanto a resposta à dor e à temperatura é comparativamente baixa1. A penetrância desse distúrbio também é diferente entre diferentes pacientes que sofrem de TEA e, portanto, a variabilidade aumenta.
O diagnóstico clínico atual de TEA é baseado na avaliação comportamental dos indivíduos, pois não há teste genético comum ou baseado em biomarcadores confirmatório que cubra todas as formas de TEA3. Decifrar as bases genéticas e neurofisiológicas seria útil para direcionar estratégias de tratamento. Na última década, um grande corpo de pesquisa resultou na identificação de centenas de genes que são excluídos ou mutados ou cujos níveis de expressão são alterados em pacientes com TEA. Pesquisas em andamento enfatizam a validação da contribuição desses genes candidatos usando organismos modelo como o camundongo ou a mosca-da-fruta, nos quais esses genes são nocauteados ou derrubados, seguidos por testes para déficits comportamentais semelhantes ao TEA e elucidação das vias genéticas e moleculares subjacentes que causam as anomalias. Um modelo de camundongo recapitulando as variações do número de cópias (CNVs) nos loci cromossômicos humanos 16p11.2 mostra alguns dos defeitos comportamentais do TEA 4,5,6. A exposição pré-natal a um medicamento teratogênico ácido valpróico (VPA) é outro modelo de camundongo que descreve características semelhantes ao TEA humano 7,8. Além disso, existe uma variedade de modelos de camundongos que exibem autismo associado à síndrome genética, por exemplo, modelos sindrômicos de gene único causados por mutações em Fmr1, Pten, Mecp2, Cacna1c e modelos não sindrômicos de gene único causados por mutações em genes como Cntnap2, Shank, Neurexin ou genes Neuroligin 5.
A mosca-da-fruta (Drosophila melanogaster) é outro organismo modelo proeminente para estudar as bases celulares, moleculares e genéticas de uma infinidade de doenças humanas9, incluindo TEA. Drosophila e humanos compartilham processos biológicos altamente conservados nos níveis molecular, celular e sináptico. As moscas-das-frutas têm sido usadas com sucesso em estudos de TEA10 , 11 , 12 para caracterizar genes ligados a TEAs e decifrar seu papel exato na sinaptogênese, função sináptica e plasticidade, montagem do circuito neural e maturação; descobriu-se que os homólogos de moscas de genes associados ao TEA têm papéis na regulação do comportamento social e / ou repetitivo 11,13,14,15,16,17,18,19,20,21. A mosca-da-fruta também tem funcionado como modelo para a triagem de genes de TEA e suas variantes 15,22,23. O maior desafio na pesquisa de TEA em moscas é que, ao contrário de outros modelos de doenças, não existe um único modelo de mosca com TEA. Para entender o impacto das mutações ou da derrubada de um gene específico do TEA, um pesquisador precisa validar se os fenótipos comportamentais imitam suficientemente os sintomas de pacientes com TEA e, em seguida, prosseguir para a compreensão dos fundamentos moleculares ou fisiológicos dos fenótipos.
Portanto, a detecção de fenótipos semelhantes ao TEA é vital para a pesquisa de TEA no modelo de mosca. Um punhado de técnicas comportamentais surgiu ao longo dos anos que nos permite detectar anormalidades como déficits no comportamento / interação social, comunicação, comportamentos repetitivos e capacidade de resposta a estímulos. Além disso, várias modificações e atualizações dessas técnicas comportamentais foram feitas em diferentes laboratórios para atender a requisitos específicos, como upscaling, automação de ensaios, leituras, quantificação e métodos de comparação. Neste artigo em vídeo, são demonstradas as versões mais básicas de cinco paradigmas comportamentais, que, em combinação, podem ser usados para detectar resultados comportamentais semelhantes ao TEA da maneira mais fácil.
A agressão é um comportamento inato evolutivamente conservado que afeta a sobrevivência e a reprodução24. O comportamento agressivo em relação aos coespecíficos é influenciado pela 'motivação para a socialização'25,26 e pela 'comunicação'27, ambos comprometidos em indivíduos afetados por TEA. O comportamento agressivo é bem descrito em Drosophila e sua quantificabilidade através do robusto ensaio de agressão 28,29,30 e uma base genética e neurobiológica bem compreendida 31 o torna um paradigma comportamental adequado32 para avaliar o fenótipo ASD em um modelo de mosca. A agressão é afetada pelo isolamento social longe de um ambiente social, o que leva a uma agressão aumentada; O mesmo foi observado quando as moscas machos são alojadas em isolamento por alguns dias33,34. Outro ensaio comportamental que quantifica a sociabilidade em moscas é o Social Space Assay35, que mede as distâncias entre os vizinhos mais próximos e as distâncias entre moscas em um pequeno grupo de moscas, tornando-o perfeitamente adequado para testar os papéis dos ortólogos do gene ASD na mosca 12,21,36,37, bem como modelos de moscas ASD induzidos pelo ambiente38, 39.
O ensaio de namoro de Drosophila é outro paradigma comportamental frequentemente usado para testar a alteração nas habilidades sociais e de comunicação em circuito ou manipulação genética, incluindo genes relacionados ao autismo 18,19,21,40. Padrões repetitivos de comportamento são prevalentes em pacientes com TEA, que são recapitulados em moscas pelo comportamento de higiene - uma série de ações distintas e estereotipadas realizadas para limpeza e outros propósitos. Ele tem sido usado com sucesso para testar o impacto de mutações no gene ASD em moscas21,41, bem como a exposição a produtos químicos 38,39. Vários avanços e automação no ensaio foram descritos antes 16,41,42,43; Aqui, estamos demonstrando o padrão de ensaio mais básico, que é fácil de adotar e quantificar.
Sabe-se que o TEA afeta a capacidade de habituação, aprendizado e memória em alguns pacientes 44,45,46,47,48,49,50, organismos modelo de TEA 51,52 e também causa déficits em diferentes comportamentos olfativos50. A habituação de salto light-off de Drosophila foi usada anteriormente para rastrear genes ASD23. A habituação pode ser testada por um método simples de ensaio de habituação olfativa 53,54,55. Descrevemos o método para induzir a habituação olfativa e analisamos o resultado usando um ensaio clássico de escolha de odor binário baseado em labirintoem Y 56 que pode ser usado para detectar defeitos na habituação no gene ASD mutante ou na condição de knockdown do gene. Para avaliar se o impacto de uma mutação (ou knock-down de genes) ou de um tratamento farmacológico no comportamento de uma mosca equivale a um fenótipo semelhante ao TEA, pode-se usar uma combinação desses 5 ensaios descritos aqui.

<table><tbody><tr><td><forte>Arena de agressão:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa padrão de 24 poços feita de poliestireno</td><td></td><td></td> transparente <td>12 cm x 8 cm x 2 cm. Diâmetro de um único poço = 18 cm. Sigma-aldrich #Z707791; profundidade = 1 cm</td></tr><tr><td>Folha</td><td></td><td></td> transparente de plástico/acrílico <td>Alternativa: uma tampa perfurada de uma placa de cultura de células</td></tr><tr><td><forte>Ensaio de espaço social:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grampos de</td><td></td><td></td> fichário <td>19 mm</td></tr><tr><td>Folhas de vidro e folhas de acrílico de tamanhos</td><td></td><td></td> personalizados <td>Espessura = 5 mm</td></tr><tr><td><forte>Ensaio de corte: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Porca e parafuso com rosqueamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Folhas de perspex de formas</td><td></td><td></td> <td>personalizadasi) Tampa: Um disco redondo transparente feito sob medida (2-3 mm de espessura, 70 mm de diâmetro) com um orifício de carregamento na região periférica e outro orifício de parafuso no centro (diâmetro ~ 3 mm para cada); ii) Um segundo disco de Perspex transparente mais espesso (3-4 mm de espessura, 70 mm de diâmetro), com 6-8 perfurações de diâmetro 15 mm, equidistante do centro; iii) Base: Igual à tampa, exceto sem o orifício de carregamento</td></tr><tr><td><forte>Ensaio de preparação: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Painel de LED</td><td></td><td></td> coberto de vidro difuso <td>10- Painel LED montável no teto de 15 Watts</td></tr><tr><td>Habituation e ensaio de labirinto em Y</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmaras</td><td></td><td></td> de escalada <td>x2, vidro de borosilicato</td></tr><tr><td>Adaptador para conectar o labirinto em Y com o frasco</td><td></td><td></td> de entrada <td>Perspex, feito sob medida, medidas em Figura 5A</td></tr><tr><td>Clear frascos</td><td></td><td></td> de reagentes <td>Borosil #1500017</td></tr><tr>Rolha <td></td><td></td><td>de lavagem de gás</td><td>Borosil #1761021</td></tr><tr><td>Frasco</td><td></td><td></td> de vidro <td>OD= 25 mm x Altura= 85 mm; Vidro de borossilicato</td></tr><tr><td>Odorante (butirato de etila)</td><td></td><td></td><td>Merck #E15701</td></tr><tr><td>Cera de parafina (líquida) light</td><td></td><td></td><td>SRL #18211</td></tr><tr><td>Grampos de</td><td></td><td></td> rolo <td>Polymed #14098</td></tr><tr><td>Tubos de</td><td></td><td></td> silicone <td>OD = 0,6 cm, ID = 0,3 cm; braçadeiras de rolo para controle de fluxo</td></tr><tr><td>Bomba</td><td></td><td></td> de vácuo <td>Hana #HN-648 (Qualquer bomba de aquário com direção de fluxo invertido manualmente)</td></tr><tr><td>Vidro borossilicato</td> <td>do labirinto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>em Y Tubo de vidro em forma de Y (vidro borosilicato)</td><td></td><td></td><td>Feito sob medida, medições em <forte>Figura 5A</forte></td></tr><tr><td><forte>Itens comuns:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qualquer software para reprodução de vídeo (por exemplo, - VLC media player)</td><td></td><td></td><td>https://www.videolan.org/vlc/</td></tr><tr><td>Computador para análise</td><td></td><td></td><td></td>de dados de vídeo</tr><tr><td>Frascos</td><td></td><td></td> de mosca <td>OD= 60 mm x Altura= 140 mm; frascos</td></tr><tr><td></td><td></td> de vidro/polipropileno<td>OD</td><td>= 25 mm x Altura= 85 mm; Software de prisma</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de bloco gráfico de vidro de borosilicato <td>https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/www.graphpad.com/scientific-software/prism/</td></tr> <tr><td>software</td><td></td><td></td> ImageJ <td>https://imagej.net/downloads</td></tr><tr><td>temporizador</td><td></td><td></td><td></td></tr> A <tr><td>câmera de vídeo com gravação de vídeo configurada Filmadora</td><td></td><td></td><td>ou uma câmera de celular funcionará</td></tr><tr><td><forte>Para Aspirador de Moscas:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Algodão</td><td></td><td></td><td>Absorvente, autoclavado</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td>Sigma-aldrich #P7793</td></tr><tr><td>Ponteiras</td><td></td><td></td> de Pipeta <td>200 &micro; L ou 1000 &micro; L, escolha depeding no diâmetro externo do tubo de silicone Comprimento do</td></tr><tr>tubo <td></td><td></td> de<td>silicone / borracha</td><td>= 30-50 cm. O tubo deve ser inodoro</td></tr><tr><td><forte>Composição do alimento para moscas:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingredientes (quantidade para 1 L de alimento)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ágar (8 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 19661 (CAS: 9002-18-0)</td></tr><tr><td>Farinha de milho (80 g)</td><td></td><td></td><td>D-glicose orgânica adquirida localmente</td></tr><tr><td>(20 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 51758 (CAS: 50-99-7)</td></tr><tr><td>Ácido propiônico (4 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 43883 (CAS: 79-09-4)</td></tr><tr><td>Sacarose (40 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 90701 (CAS: 57-50-1)</td></tr><tr><td>Tego (Metil para hidroxibenzoato) (1,25 g)</td><td></td><td></td><td>SRL # 60905 (CAS: 5026-62-0)</td></tr><tr><td>Levedura em pó (10 g)</td><td></td><td></td><td>HIMEDIA # RM027</td></tr><tr><td><forte>Linhas de mosca usadas nos experimentos deste estudo:</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tipo selvagem (Cantão S ou CS)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 64349</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>BDSC # 3605</td></tr><tr><td>w[1118]; fmr1[&delta; 50M]/TM6B, Tb[+]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 6930</td></tr><tr><td>w[*]; fmr1[&delta; 113M]/TM6B, Tb[1]</td><td></td><td></td><td>BDSC # 67403</td></tr><tr><td>MB247-GAL4 (Gaurav Das, NCCS Pune, Índia)</td><td></td><td></td><td>BDSC # 50742</td></tr><tr><td>LN1-GAL4</td><td></td><td></td><td>NP1227, consórcio NP, Japão</td></tr><tr><td>row-shRNA</td><td></td><td></td><td>BDSC # 25971</td></tr></tbody></table>

paradigmas para avaliação comportamental no modelo de drosophila de transtorno do espectro do autismo

Paradigms for Behavioral Assessment in Drosophila Model of Autism Spectrum Disorder

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) engloba um grupo heterogêneo de transtornos do neurodesenvolvimento com sintomas comportamentais comuns, incluindo déficits na interação social e capacidade de comunicação, comportamentos restritos ou repetitivos aprimorados e também, em alguns casos, dificuldade de aprendizagem e déficit motor. Drosophila serviu como um organismo modelo incomparável para modelar um grande número de doenças humanas. Como muitos genes foram implicados no TEA, as moscas-das-frutas surgiram como uma maneira poderosa e eficiente de testar os genes supostamente envolvidos com o distúrbio. Como centenas de genes, com papéis funcionais variados, estão implicados no TEA, um único modelo genético de TEA é inviável; em vez disso, mutantes genéticos individuais, knockdowns de genes ou estudos baseados em superexpressão dos homólogos de moscas de genes associados ao TEA são os meios comuns para obter informações sobre as vias moleculares subjacentes a esses produtos gênicos. Uma série de técnicas comportamentais estão disponíveis em Drosophila , que fornecem fácil leitura de déficits em componentes comportamentais específicos. O ensaio de espaço social e os ensaios de agressão e namoro em moscas têm se mostrado úteis na avaliação de defeitos na interação social ou comunicação. O comportamento de higiene em moscas é uma excelente leitura do comportamento repetitivo. O ensaio de habituação é usado em moscas para estimar a capacidade de aprendizado de habituação, que é afetada em alguns pacientes com TEA. Uma combinação desses paradigmas comportamentais pode ser utilizada para fazer uma avaliação completa do estado da doença semelhante ao TEA humano em moscas. Usando moscas mutantes Fmr1 , recapitulando a síndrome do X frágil em humanos e knockdown de linha homóloga a POGZ em neurônios de moscas, mostramos déficits quantificáveis no espaçamento social, agressão, comportamento de cortejo, comportamento de higiene e habituação. Esses paradigmas comportamentais são demonstrados aqui em suas formas mais simples e diretas, com a suposição de que isso facilitaria seu uso generalizado para pesquisas sobre TEA e outros distúrbios do neurodesenvolvimento em modelos de moscas.

Ensaio de agressão Como modelo de ASD de mosca, moscas mutantes Fmr1 foram usadas63,64. w1118 machos foram usados como controle e Fmr1 trans-heterozigoto Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M57 moscas machos como moscas experimentais; Os machos adultos foram alojados em tubos de isolamento por 5 dias. Machos homotípicos (mesmo genótipo, mesmas condições de alojamento) foram introduzidos na arena de agressão e seu comportamento foi registrado por 20 min. O número total de lutas agressivas em 20 min foi contado para cada genótipo. O número de ataques agressivos durante 20 minutos foi significativamente reduzido no caso de machos mutantes do que nos machos de controle (Figura 1E). Essa agressividade reduzida em moscas Fmr1 pode ser devido ao interesse reduzido na interação social com outra mosca. Em contraste, as moscas machos mutantes Fmr1 em grupo/socialmente alojadas mostram contagens de ataques de agressão comparáveis às das moscas w1118 socialmente alojadas (dados não mostrados), provavelmente indicando um papel positivo do ambiente social na indução do comportamento social.
Ensaio de Espaço Social O ensaio do espaço social foi realizado em w1118 e moscas modelo ASD (Fmr1Δ113M/Fmr1Δ50M). A distância até o vizinho mais próximo foi calculada para cada mosca e 10 repetições biológicas foram realizadas para cada genótipo. As moscas mutantes mostram distâncias de vizinhos mais próximos significativamente maiores do que as contrapartes de controle (Figura 2D), indicando uma preferência por maior distanciamento de outras moscas.
Ensaio de namoro O ensaio de namoro de moscas machos alojadas em um único foi realizado para quantificar o comportamento inato de corte de duas moscas modelo de TEA separadas. Primeiro, o comportamento de corte das moscas trans-heterozigóticas Fmr1 foi comparado com o de w1118; As moscas Fmr1 mostraram um índice de namoro significativamente menor, bem como um número reduzido de tentativas de cópula (Figura 3E1). Em um segundo experimento, row, um ortólogo de Drosophila do gene POGZ humano (um gene de risco de TEA20 altamente prevalente, foi derrubado pela expressão de um microRNA de grampo curto contra a linha em neurônios do corpo de cogumelo usando a linha de driver MB247-GAL4. Essas moscas modelo ASD knockdown foram testadas para qualquer defeito no padrão de namoro inato; O índice de namoro e o número de tentativas de cópula foram calculados a partir de vídeos de 15 minutos. As moscas knockdown mostraram um índice de namoro significativamente reduzido, bem como contagens de tentativa de cópula (Figura 3E2), indicando sua comunicação defeituosa com as fêmeas.
Comportamento de higiene O comportamento de aliciamento é usado como uma leitura para comportamento repetitivo em Drosophila 16,42,43. O comportamento de limpeza foi quantificado em moscas trans-heterozigóticas Fmr1 e comparado com o de w1118. A latência para a primeira limpeza é significativamente reduzida em moscas Fmr1, enquanto a duração média da sessão de limpeza e o índice de limpeza são significativamente aumentados em moscas Fmr1 (Figura 4C), indicando comportamento aprimorado de limpeza (ou repetitivo) em moscas modelo ASD. Em contraste, o número total de episódios de limpeza nas moscas mutantes não foi alterado significativamente em comparação com o das moscas de controle.
Ensaio de habituação olfativa A habituação é considerada defeituosa em um grande número de indivíduos autistas e pode ser usada como um ensaio para o mesmo em Drosophila23. Aqui, a habituação olfativa foi testada no modelo ASD, derrubando a linha em interneurônios locais olfativos acionados por LN1-GAL4. Um odor aversivo, 20% de butirato de etila, tem sido usado nesses experimentos para induzir a habituação nessas moscas. Os resultados mostram que as moscas knockdown não se habituaram após uma exposição ao odor de 3 dias (as duas últimas barras no gráfico na Figura 5E não mostram uma diferença significativa entre moscas ingênuas e habituadas) em comparação com as moscas selvagens, que mostram habituação típica após a exposição ao butirato de etila por 3 dias (moscas expostas mostram queda significativa no índice de desempenho em comparação com moscas ingênuas). Isso indica que as moscas knockdown não se habituam após a exposição ao butirato de etila por 3 dias e são repelidas pelo odor repulsivo, provando que essas moscas ASD são deficientes em habituação.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig01.jpg"> Figura 1: Arena de agressão e padrões comportamentais representativos. (A) A configuração da arena de agressão em uma placa de 24 poços com tampa perfurada para entrada de moscas. Inserção: Dimensões de uma única arena com comida de mosca. (B) Fotografia de um tubo de caixa única contendo uma única mosca macho isolada e um frasco de alojamento em grupo contendo moscas machos e fêmeas, recapitulando um ambiente social. (C) Um aspirador para transferência de moscas baseada em aspiração bucal. Itens necessários para a montagem de um aspirador de moscas indicando os lados do tubo para entrada de mosca (extremidade de mosca) e o lado que seria inserido na boca (extremidade da boca) (C1) e um aspirador de mosca montado (C2). (D) Padrões comportamentais agressivos representativos de macho-macho: abordagem, ameaça de asa, esgrima, segurar, investir, boxear e lutar. (E) As moscas machos mutantes Fmr1 mostram comportamento agressivo reduzido em relação a outros machos em comparação com os controles. Gráfico de caixa mostrando o número de ataques agressivos para machos socialmente isolados de w1118 (controle) versus moscas trans-heterozigóticas Fmr1 (Fmr1Δ113M / Fmr1Δ50M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig02.jpg"> Figura 2: Configuração da arena de ensaio do espaço social. (A) Diagrama mostrando as dimensões e disposição dos painéis de vidro e espaçadores de acrílico. (B) O arranjo final dos componentes da arena onde os espaçadores de acrílico são imprensados entre as peças de vidro, deixando uma pequena lacuna para a entrada da mosca na parte inferior. O espaço triangular criado entre peças de vidro e espaçadores é a arena SSA para as moscas, aqui as moscas só podem se mover em duas dimensões. (C) Fotografia da configuração final da arena SSA com moscas dentro da câmara. Abreviação: SSA = matriz de espaço social. (D) As moscas modelo ASD (Fmr1 transheterozigoto) mostram maior distanciamento umas das outras no ensaio de espaço social em comparação com w1118. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig03v2.jpg"> Figura 3: Arena de namoro e padrões comportamentais representativos. Diagramas mostrando (A) desenho e (B) disposição dos discos em uma arena de ensaio de cortejo. (C) Foto da arena de namoro após o arranjo final. (D) Imagens representativas mostrando padrões comportamentais de namoro de um macho ingênuo em relação a uma fêmea acasalada: perseguição, orientação, oscilação das asas, lambidas, tentativa de cópula e cópula. (E) Gráficos mostrando o índice de namoro e o número de tentativas de cópula em dois modelos de TEA: (E1) Moscas mutantes Fmr1 mostrando redução significativa no índice de namoro e tentativa de cópula em comparação com o controle w1118 . (E2) moscas knockdown de linha foram usadas como outro modelo de TEA onde row-shRNA foi expresso emneurônios do corpo de cogumelo (MB247-GAL4); Uma redução significativa no comportamento de corte foi observada após o knockdown da linha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig04.jpg"> Figura 4: Configuração da arena e padrões comportamentais representativos do comportamento de higiene. (A) A arena em forma de disco ou roda (mesma arena de namoro mostrada na Figura 3) é montada em um painel de LED com um difusor para iluminação uniforme na parte inferior e o vídeo foi capturado na parte superior. Isso garante um maior contraste necessário para identificar o movimento fino dos apêndices durante a escovação. (B) Fotografias de padrões de comportamento de higiene observados em moscas machos adultas. T1 =1º par de pernas, T2 =2º par de pernas, T3 = terceiro par de pernas. A nomenclatura abreviada intuitiva é usada para padrões de preparação em B: T1-cabeça = cabeça esfregada com as primeiras pernas; T1-T1 = primeiro par de pernas esfregadas e assim por diante. Abreviatura: LED = diodo emissor de luz. (C) Gráficos mostrando os resultados do ensaio de aliciamento realizado em moscas trans-heterozigóticas Fmr1 e comparados com w1118. As moscas mutantes Fmr1 mostraram latência significativamente reduzida para a primeira sessão de preparação, indicando o início precoce da limpeza em comparação com o controle. Além disso, a duração média da sessão de limpeza e o índice de limpeza foram significativamente aumentados em mutantes Fmr1 , indicativo de comportamento repetitivo aprimorado em moscas modelo de TEA. Em contraste, o número total de episódios de limpeza não foi alterado significativamente nas moscas mutantes em comparação com o controle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66649/66649fig05.jpg"> Figura 5: Configuração de indução e ensaio para habituação olfativa e resultado representativo após o ensaio. (A) Componentes da configuração do ensaio de escolha de odor binário: (A1) o labirinto em Y, (A2) o adaptador, (A3) o arranjo desses dois, (A4) um par de tubos de coleta para fixação na parte superior dos braços do labirinto em Y, (A5) a garrafa de vidro e os tubos de vidro para manter a solução odorífera ou a água através da qual o ar borbulha antes de passar para o labirinto em Y. (B) Configuração de garrafa de comida para mosca para indução de habituação olfativa; diagrama de desenho animado (B1) mostra como o tubo de microcentrífuga contendo odor é pendurado em um fio de cobre no meio do caminho dentro da garrafa; (B2) finalmente, a abertura da garrafa é coberta por algodão e selada por envelopes de papel pardo. (C) Foto do arranjo total da configuração do labirinto em Y. (D) Fotografias mostrando a distribuição de moscas em câmaras de coleta após o término de um experimento. (D1) Moscas ingênuas (expostas apenas à parafina inodora, controle) mostram repulsa pelo odor aversivo (butirato de etila a 20% usado para indução de habituação neste estudo) e escolhem no braço do labirinto em Y cheio de ar regular, enquanto as moscas expostas (habituadas) (D2) se distribuem uniformemente em ambos os braços. Abreviatura: ID = diâmetro interno. (E) Os resultados do ensaio de habituação olfativa de moscas knockdown mostraram defeito de habituação. As moscas do tipo selvagem (Cantão S), após 3 dias de exposição ao butirato de etila, apresentaram uma redução significativa no índice de desempenho em comparação com as moscas virgens, indicativas de habituação. Quando progênies de moscas LN1-GAL4 x row-shRNA foram expostas por 3 dias, o índice de desempenho não foi significativamente diferente do de moscas virgens; isso demonstra que essas moscas knockdown não se habituaram após a exposição de 3 dias ao odorante, recapitulando um sintoma semelhante ao TEA humano. Abreviaturas: TEA = transtorno do espectro autista; shRNA = RNA em grampo curto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66649/66649fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O Transtorno do Espectro do Autismo (TEA) está associado ao comportamento social e comunicativo prejudicado e ao surgimento de comportamento repetitivo. Para estudar a inter-relação entre genes de TEA e déficits comportamentais no modelo de Drosophila , cinco paradigmas comportamentais são descritos neste artigo para testar o espaçamento social, agressão, namoro, aliciamento e comportamento de habituação.

Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

Autism Spectrum Disorder (ASD) encompasses a heterogeneous group of neurodevelopmental disorders with common behavioral symptoms including deficits in ...

O transtorno do espectro do autismo afeta crianças, levando a comunicação prejudicada, comportamento social e comportamento repetitivo aprimorado. Drosophila é um modelo cada vez mais popular para a pesquisa do autismo para decifrar as vias moleculares subjacentes. Descrevemos um conjunto de técnicas padrão para caracterização comportamental de modelos de autismo de moscas.Para decodificar os fundamentos moleculares do transtorno do espectro do autismo em moscas, suas manifestações comportamentais devem ser estabelecidas com precisão. Quantificar os traços comportamentais humanos do autismo em Drosophila melanogaster é uma tarefa bastante desafiadora. Não existe um único paradigma comportamental em moscas que aborde todas as anomalias comportamentais desse distúrbio.Descrevemos um conjunto de cinco paradigmas comportamentais bem estabelecidos em Drosophila, a saber, ensaio de agressão, ensaio de espaço social, formato da pelagem, higiene e ensaio de habituação. Tudo isso pode ser usado em modelos de moscas com TEA para caracterizar e quantificar o nível de deficiências no comportamento comunicativo, comportamento repetitivo e comportamento social. Descrevemos essas cinco técnicas em sua forma mais simples, para que todos os laboratórios com instalações mínimas de pesquisa de moscas possam adotá-las com facilidade e realizar experimentos no modelo de mosca do transtorno do espectro do autismo e contribuir para o avanço de nossa compreensão dessa doença.

paradigms-for-behavioral-assessment-drosophila-model-autism-spectrum

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a evitação de indivíduos estressados. Este paradigma é poderoso, mas fácil de usar, e pode ser usado para avaliar a influência de genes e ambiente em um tipo de interação social em Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social Drosophila melanogaster

Comportamentos repetitivos e restritos de ordem superior (RRBs) perturbam a vida dos indivíduos afetados.  Esses comportamentos são difíceis de modelar em roedores, dificultando a pesquisa biomédica básica sobre possíveis tratamentos ou intervenções para RRBs.  Aqui, descrevemos a exploração de novos objetos como um ensaio potencial para RRBs de ordem superior em camundongos.

Exploração objeto romance como um ensaio de Potencial de ordem superior comportamentos repetitivos em Ratos

Modelos de roedores são ferramentas valiosas para estudar comportamentos centrais relacionados ao transtorno do espectro do autismo (TEA). Neste artigo, expomos dois testes comportamentais para modelar as principais características do TEA em camundongos: auto-limpeza, que avalia o comportamento repetitivo, e o teste de interação social de três câmaras, que documenta deficiências sociais.

Estratégias para avaliar comportamentos semelhantes aos autistas em camundongos

O procedimento descrito neste protocolo mostra que a administração de testosterona e crenças populares sobre a testosterona pode estar associada diretamente oposta comportamentos sociais.

Combinando Behavioral Endocrinologia e Economia Experimental: Decisão da testosterona e Social Fazendo

Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Como destreza manual é uma prerrogativa principalmente de primatas, tarefas comportamentais têm sido desenvolvidos nos macacos. Quatro alcançar e agarrar a preensão tarefas, medir a capacidade de mão de manipulação e força, permitem estabelecer a recuperação funcional após uma lesão do sistema nervoso central e para testar o efeito de um tratamento.

Avaliação comportamental de destreza manual em primatas não-humanos

Responder por sinais de alimentos ou drogas emparelhados aumenta ao longo de um período de abstinência e esta pode estar relacionada com uma susceptibilidade aumentada a comportamentos recaída. Aqui detalhamos um procedimento para avaliar este "incubação de desejo" em ratos que têm auto-administrado de sacarose.

Um método geral para a avaliação de Incubação de Craving Sacarose em Ratos

Ritmos circadianos voluntária rodas execução de atividade em mamíferos está intimamente ligado às oscilações moleculares de um relógio mestre no cérebro. Como tal, estes ritmos diários de comportamento pode ser utilizado para estudar a influência dos factores genéticos, farmacológicos e ambientais sobre o funcionamento deste relógio circadiano.

Registro e análise dos ritmos circadianos em Running rodas Atividade em Roedores

Este protocolo descreve uma maneira simples e econômica de identificar individualmente Drosophila ou outros insetos. Dados de demonstração que investigam o sucesso do acasalamento em três espécies de Drosophila mostram que este método é comparável ou melhor do que o uso de anestesia com CO2.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Para identificar novas mutações que afetam a mecanosensação, projetamos um ensaio que mede a resposta comportamental à estimulação tátil de cerdas de moscas em clones mutantes gerados pelo método MARCM. A combinação de técnicas permite a identificação de mutações mecanossensíveis que, de outra forma, seriam letais.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aprenda cinco paradigmas comportamentais em Drosophila para avaliar transtorno do espectro autista, incluindo agressão, espaçamento social, cortejo, higienização e habituação. Esses métodos padronizados permitem quantificar déficits comportamentais ligados ao TEA.

Paradigmas para Avaliação Comportamental no Modelo de Drosophila de Transtorno do Espectro do Autismo

Explorar mais vídeos