Extração e Detecção de Geosmina e 2-Metilisoborneol em Água e Peixes usando Sondas de Extração Sortiva de Alta Capacidade e GC-MS

[Narrador] Neste vídeo, demonstraremos o processo de extração e detecção de geosmina e 2-metilisoborneol de amostras de água e peixe usando sondas de extração sortiva de alta capacidade e cromatografia gasosa-espectrometria de massa, ou GC-MS. Geosmina e 2-metilisoborneol são compostos orgânicos voláteis de origem microbiana que ocorrem em córregos, lagoas, poços ou mesmo sistemas de aquicultura de recirculação. Esses compostos odorantes podem conferir odores e sabores desagradáveis à água e aos peixes cultivados nela, mesmo em concentrações extremamente baixas. Aqui vemos um cientista coletando água de um sistema de aquicultura de recirculação. Geosmina e 2-metilisoborneol amostras de água são coletadas em frascos de vidro marrom classificados para VOCs sem ar restante no frasco. Para fazer isso, mergulhe e tampe o frasco debaixo d'água para que não haja bolhas de ar. Começamos preparando nossa calibração e padrões internos. Primeiro, prepare uma solução estoque rotulada como C1 adicionando 10 microlitros de geosmina e solução de 2-metilisoborneol a 100 microgramas por litro de concentração a um balão volumétrico de 100 mililitros. Encher o balão até à marca de volume com o metanol de qualidade LC/MS. Isso resulta em uma solução contendo cada analito a uma concentração de 10 microgramas por litro. Em seguida, os padrões de calibração são preparados adicionando volumes especificados da solução estoque C1 aos frascos volumétricos de 100 mililitros e enchendo até o volume com água deionizada. É importante preparar novos padrões de calibração diariamente, pois essas soluções são extremamente perecíveis. Para os padrões internos, crie a solução estoque I1 adicionando 10 microlitros de 2-isopropil-3-metoxipirazina, também conhecida como IPMP, em um frasco volumétrico de um litro cheio de metanol de grau LC / MS, perfazendo uma solução estoque de 10 miligramas por litro. Em seguida, prepare uma segunda solução I2 adicionando cem microlitros da solução estoque I1 a um balão volumétrico de cem mililitros e enchendo com água deionizada para atingir uma concentração de 10 microgramas por litro. Comece colocando uma amostra de água do frasco de 20 mililitros na bandeja de amostras. Pese 2,5 gramas de cloreto de sódio e adicione-o a cada frasco de amostra. A adição de sal aumenta a transferência de geosmina e MIB da água para o headspace. Adicione cinco mililitros da amostra de água a cada frasco e tempere-o com 50 microlitros da solução padrão interna I2. Tampe e feche cada frasco imediatamente após a preparação para minimizar a perda de analitos. O próximo passo é a extração do analito. Coloque a bandeja de amostra no suporte da bandeja do amostrador automático e prepare o método do instrumento com as seguintes configurações principais: Tempo de agitação de pré-amostragem em 10 minutos. Parâmetros de amostragem: Incubar a 65 graus Celsius por 30 minutos com uma velocidade de agitação de 400 RPM. Certifique-se de que a opção de sonda Wash HiSorb esteja habilitada para evitar contaminação cruzada entre amostras. Dessorção da sonda: Defina por 15 minutos a 270 graus Celsius. Configurações do purgador: Uma temperatura de carga do purgador de 25 graus Celsius e uma taxa de fluxo dividida de oito mililitros por minuto. Uma vez que essas configurações estejam em vigor, inicie o amostrador automático em conjunto com o método GC-MS para análise de amostra de água. Para análise de tecido de peixe, coloque um frasco de 20 mililitros por peixe sample na bandeja. Homogeneizar o tecido de peixe usando um processador de alimentos e pesar um grama do tecido homogeneizado em cada frasco. Adicione cinco mililitros de uma solução saturada de cloreto de sódio e espague cada amostra com 100 microlitros da solução padrão interna I2. Tampe e feche cada frasco imediatamente. O método de extração para amostras de peixes é semelhante ao da água, mas com diferenças importantes devido à natureza rica em lipídios do tecido do peixe. Essas diferenças incluem o tempo de agitação pré-amostragem: Defina para 20 minutos. Temperatura de incubação da amostragem: 80 graus Celsius por 30 minutos com uma velocidade de agitação de 400 RPM. Certifique-se de que a função de sonda Wash HiSorb esteja ativada. Quando essas etapas estiverem concluídas, execute o amostrador automático em conjunto com o método GC-MS para análise de amostras de peixes, Os mesmos parâmetros GC-MS se aplicam aos métodos de água e tecido de peixe. O GC está equipado com cinco colunas MS de 30 metros por 0,25 milímetros por 0,25 mícrons. Um hélio ultrapuro é usado como gás transportador, com uma vazão de dois mililitros por minuto. O programa do forno começa com uma temperatura inicial de 60 graus Celsius mantida por três minutos, seguida por uma rampa de temperatura de 10 graus Celsius por minuto a 100 graus Celsius, depois 20 graus Celsius por minuto a 190 graus Celsius e 30 graus Celsius por minuto a 280 graus Celsius com um tempo de espera final de dois minutos. O tempo total de execução é de aproximadamente 16,5 minutos. Para a linha de transferência entre o GC e o MS, defina a temperatura para 280 graus Celsius com a fonte de íons a 250 graus Celsius e a quádrupla a 200 graus Celsius. No modo MS para varredura, use uma faixa de 50 a 350 relação massa-carga. Para monitoramento de íons selecionados, ou SIM, use os seguintes íons para quantificação e confirmação: IPMP, relação massa-carga de 152 e 137. MIB, relação massa-carga de 95 a 107. E geosmina, 112 e 55 relação massa-carga. Por fim, sempre revise manualmente as seleções de pico em seu software de cromatografia para evitar erros. Este protocolo descreve as etapas para a detecção de geosmina e 2-metilisoborneol em amostras de água e peixes utilizando sondas de extração sortiva de alta capacidade e GC-MS. Seguindo cuidadosamente essas instruções, os pesquisadores podem garantir resultados precisos e confiáveis na análise da presença desses compostos. A Figura Um mostra o efeito da temperatura de dessorção da sonda no transporte. Um padrão de laboratório contendo geosmina e 2-metilisoborneol a 20 nanogramas por litro foi analisado em três diferentes temperaturas de dessorção da sonda. O painel A fornece as áreas médias de pico para geosmina e MIB. Cada sonda foi posteriormente dessorvida mais duas vezes na mesma temperatura inicial para avaliar o transporte. Os resultados para geosmina e MIB são mostrados nos painéis B e C, respectivamente. A transferência é expressa como a área de pico como uma porcentagem da área de pico inicial. As barras de erro representam o desvio padrão em três replicações. Os resultados indicam que uma temperatura de dessorção mais alta minimiza o transporte sem comprometer a sensibilidade. A Figura Dois representa uma comparação da recuperação de dados corrigida versus não corrigida para padrões analíticos de 15 e 40 nanogramas por litro usando sondas PDMS para extração. As amostras foram corrigidas com o uso de 2-isopropil-3-metoxipirazina, ou IPMP, como padrão interno. Sem correção, a recuperação foi significativamente menor, com correções em aproximadamente 60% dos valores aumentados conhecidos. Uma vez corrigida, a recuperação foi próxima de 100%, demonstrando a importância do uso de padrões internos para quantificação precisa. A Figura Três compara os dados de recuperação de geosmina à esquerda e 2-metilisoborneol à direita a 15 nanogramas por litro usando dois tipos de sondas: sondas somente PDMS e trifásicas, que incluem PDMS, divinilbenzeno e ampla faixa de carbono. Ambos os tipos de sondas mostram bom desempenho, embora as sondas somente PDMS tenham taxas de recuperação ligeiramente melhores. Diante desse resultado e da economia de custos, análises futuras foram realizadas com sondas somente PDMS. A Figura Quatro mostra a regressão linear das curvas de calibração para geosmina e MIB. O intervalo sólido representa geosmina com um valor de R-quadrado de 0,9999, e a linha tracejada representa MIB, também com um valor de R-quadrado de 0,9999. Ambas as curvas demonstram excelente linearidade com erro mínimo, validando a precisão quantitativa do método na faixa de concentração testada. A Figura Cinco ilustra as concentrações de geosmina e 2-metilisoborneol em amostras de água retiradas de sete diferentes sistemas de aquicultura. O painel A mostra as concentrações de geosmina e o painel B mostra as concentrações de MIB. Cada sistema teve pelo menos três repetições e, na maioria dos casos, as concentrações desses compostos estavam acima dos limites de detecção do método. Um sistema, rotulado como sistema um, excedeu o limite de odor humano para geosmina, destacando um problema potencial com a qualidade da água nesse sistema. A Figura Seis fornece dados de duas amostras de peixes, rotuladas como F1 e F2, que foram enriquecidas com geosmina e 2-metilisoborneol. Ambos os compostos foram analisados em triplicata para determinar a recuperação e precisão. As concentrações de geosmina e MIB e as amostras de peixes enriquecidos são plotadas, demonstrando a capacidade do método de detectar com precisão esses compostos, mesmo em tecidos de peixes ricos em lipídios. Os métodos descritos hoje fornecem uma estrutura robusta para a detecção sensível de geosmina e 2-metilisoborneol. Por meio da integração de sondas de extração sortiva de alta capacidade e análise precisa de GC-MS, demonstramos uma técnica que aprimora significativamente nossas capacidades de detecção. Esse avanço metodológico não apenas melhora o rendimento, mas também reduz o risco de erro humano e aumenta a reprodutibilidade dos resultados. À medida que continuamos a refinar essas técnicas, elas se tornarão, sem dúvida, ferramentas indispensáveis no campo do monitoramento ambiental e da avaliação da qualidade dos alimentos.