Isolamento baseado em citometria de fluxo e avaliação terapêutica de linfócitos infiltrantes de tumor em um modelo de câncer de pâncreas em camundongo

Nós nos concentramos no desenvolvimento de um método para isolar e transferir adotivamente linfócitos infiltrantes de tumor, TILs, em um modelo de câncer de pâncreas. Estamos tentando responder se os subconjuntos de TILs podem efetivamente direcionar e matar tumores pancreáticos in vivo e como as células T podem ser otimizadas para futuros ensaios clínicos. Desenvolvimento recente em terapia celular adotiva, incluindo o aprimoramento das técnicas de isolamento e expressão de TIL, modificando suavemente os TILs para melhorar seu direcionamento e a combinação da terapia TIL com outras imunoterapias, como inibidores de checkpoint ou terapias direcionadas para maior eficácia antitumoral.

Estabelecemos um método robusto para isolar e expandir TILs reativos a tumores de modelos de camundongos com câncer de pâncreas. Demonstramos maior eficácia antitumoral de células T reativas a tumores transferidas adotivamente. Nosso protocolo oferece uma abordagem mais direcionada à terapia celular adotiva, permitindo o isolamento e a seleção de TILs específicos do tumor em comparação com outros métodos menos específicos.

Ele também é usado por imagens bioluminescentes para monitoramento não invasivo de tumores. Nossas descobertas avançarão no campo, fornecendo um modelo pré-clínico padronizado para avaliar a eficácia da terapia TIL e otimizar os parâmetros de tratamento de subconjuntos de células T para câncer de pâncreas. Para preparar uma suspensão de células KPC-Luciferase para induzir um tumor pancreático ortotópico em camundongos, tripsinize a linha celular KPC-Luciferase por um minuto a 37 graus Celsius.

Após a tripsinização, adicione PBS, transfira as células e, em seguida, centrifugue a suspensão celular. Conte as células e ressuspenda-as a uma concentração de 1 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro em PBS contendo 30% de matriz de membrana basal. Coloque o mouse anestesiado em uma plataforma de operação.

Depois de fazer uma incisão abdominal esquerda de 0,5 a 1 centímetro, segure o baço com uma pinça e exponha o pâncreas. Depois de preparar as células KPC-luciferase e a mistura da matriz da membrana basal, injete 50 microlitros da suspensão celular contendo 50.000 células no pâncreas usando uma agulha de calibre 29. Retorne o pâncreas para a cavidade abdominal.

Suturar sequencialmente o peritônio e a pele. Deixe o mouse se recuperar em uma almofada quente até que esteja totalmente acordado. Após sete dias, injete intraperitonealmente no camundongo 60 microlitros de solução de sal de D-luciferina potássica para imagens ao vivo.

Após a anestesia, posicione o mouse no sistema de imagem in vivo para detecção de bioluminescência. Após a imagem, remova o mouse do sistema e permita que ele se recupere naturalmente da anestesia. Para começar, coloque o camundongo sacrificado do doador em uma plataforma operacional.

Esterilize todo o corpo com 75% de etanol. Em um capuz estéril, use tesouras e fórceps para abrir a cavidade abdominal. Remova o tumor e coloque-o em PBS no gelo.

Meça o tamanho do tumor com um calibre Vernier. Em seguida, calcule o volume do tumor usando a fórmula na tela. Depois de preparar a solução de digestão 1X usando colagenase, Dispase II e DNAse I em RPMI 1640, adicione um a dois mililitros da solução por poço em uma placa de 12 poços.

Pique os tumores em pequenos pedaços usando uma tesoura. Transfira os pedaços do tumor para cada poço de uma placa de 12 poços e digeri-los a 37 graus Celsius enquanto agita a 70 RPM por 30 minutos. Para terminar a digestão, adicione um a dois mililitros de soro bovino fetal a 10% e transfira a suspensão celular para um tubo de coleta.

Lave os poços de uma placa de 12 poços duas vezes com PBS para coletar as células restantes. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 micrómetros, picar e esmagar os fragmentos de tecido para libertar as células individuais utilizando a extremidade plana de um êmbolo de seringa. Centrifugar o filtrado a 400 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius e ressuspender o sedimento em albumina de soro bovino a 5% para coloração por citometria de fluxo.

Para começar, coloque as células isoladas do camundongo portador de tumor junto com as células mononucleares do baço ou do sangue periférico do camundongo sem tumor em uma plataforma de trabalho. Corar as células com bloqueadores de FC e anticorpos de fluxo em uma diluição de 1 a 100. Incube os tubos no gelo no escuro por 30 minutos.

Após a incubação, lave as células duas vezes em PBS por centrifugação antes de ressuspendê-las em albumina de soro bovino a 1% em PBS. Em um citômetro de fluxo, para classificar células CD45 + CD3 +, bloqueie células vivas com base em FSC-A e SSC-A para criar a porta P1. Em seguida, gate células únicas de P1 com base em FSC-A e FSC-H para criar a porta P2. Separe as células CD45 + CD3 + de P2 usando CD45 e CD3 gating. Colete as células classificadas em tubos de coleta.

A centrífuga classificou as células CD45 + CD3 + a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda as células no soro de camundongo a uma concentração de 1 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro e coloque-as no gelo. Coloque o camundongo receptor induzido por tumor em uma plataforma operacional.

Usando uma seringa de insulina de calibre 29 de 1/2 polegada, injete intraperitonealmente as células imunes classificadas. Em seguida, administre interleucina-2 por via intraperitoneal por três dias consecutivos.