Detecção rápida e específica de infecções por Acinetobacter baumannii usando um sistema baseado em amplificação da polimerase recombinase/Cas12a

Minha pesquisa se concentra em doenças respiratórias e infecções. Abordarei as tecnologias atuais que avançam neste campo e as lacunas de pesquisa de todo o campo do projeto. As principais tecnologias de que estamos falando aqui incluem sequenciamento de próxima geração, CRISPR, sequenciamento de RNA de célula única e modelos de análise de órgãos. Eles têm uma figura dura em relação ao diagnóstico no trabalho padrão de doenças cardíacas e apresentam um tratamento melhor. Meu protocolo aborda a necessidade de detecção rápida e específica de Acinetobacter baumannii, superando a limitação em questões diagnósticas atuais, como técnicas demoradas e baseadas em cultura.

[Narrador] Para começar, projete 12 pares de primers usando ferramentas de design de primer com base em princípios de design padrão. Obtenha quatro primers diretos e três primers reversos para compor 12 pares de primers. Avalie cada par de primers quanto à especificidade e eficácia usando a ferramenta Primer-BLAST do National Center for Biotechnology Information. Em seguida, projete o RNA CRISPR ou RNA guia ou gRNA usando a sequência de andaime de RNA CRISPR LbaCas12a como a sequência fixa. Incorpore um segmento específico do alvo, garantindo que o motivo adjacente do protoespaçador ou PAM esteja localizado na extremidade de cinco primos da fita não complementar. Para a construção do plasmídeo recombinante positivo, primeiro amplifique o segmento de rDNA de Acinetobacter baumannii 16S usando os conjuntos de primers direto e reverso. Prepare a mistura de reação de PCR de 50 microlitros conforme indicado na tela. Defina as condições de ciclo de PCR na máquina de PCR. Depois de purificar o produto de PCR positivo, clone-o em um vetor PUC57 que foi digerido com as enzimas BamHI e SalI. Diluir o plasmídeo recombinante positivo em série em incrementos de dez vezes com água bidestilada esterilizada. Armazene o plasmídeo diluído a menos 20 graus Celsius para experimentos adicionais. Em seguida, misture o tampão de reidratação sem primer, primers direto e reverso de A. baumannii e água bidestilada até um volume final de 465 microlitros. Vortex e gire brevemente a mistura antes de transferi-la para tubos de reação enzimática do kit RPA. Misture bem e adicione 25 microlitros de acetato de magnésio 280 milimolar. Em seguida, pipete um microlitro do plasmídeo recombinante positivo, contendo 10⁷ cópias por microlitro para a solução A com diferentes pares de primers. Incubar a solução a 39 graus Celsius durante 20 minutos. Em seguida, purifique os produtos amplificados usando um kit de purificação RPA. Execute o produto purificado em um gel de agarose a 1% a 120 volts por 10 minutos para identificar o par de primers com a banda mais brilhante e larga. Para otimizar o sistema de amplificação RPA, mantenha as concentrações de todos os outros componentes da reação constantes enquanto ajusta o volume final da solução A para 465 microlitros. Em seguida, adicione volumes apropriados de água bidestilada livre de RNA para obter as concentrações finais de primer conforme indicado e incube. Depois de purificar e eletroforesar o produto RPA, identifique a concentração ideal do primer e o tempo de incubação analisando a intensidade e a distribuição da banda. Para preparar a solução B, misture repórter de DNA de fita simples, tampão de reação CAST12a, CRISPR RNA CAST12a e água bidestilada até um volume final de 15 microlitros. Adicione cinco microlitros do produto de amplificação da polimerase recombinase ou RPA na solução B. Misture bem até ficar homogêneo. Coloque as amostras em um instrumento de PCR quantitativo de fluorescência. Para testes de especificidade, obtenha modelos de DNA de várias espécies usando um kit de extração de DNA de referência ou fervendo bactérias em água. Use a água como controle negativo. Transfira 10 nanogramas, ou um microlitro, dos moldes de DNA para a solução A contendo primers diretos e reversos. Em seguida, pipete 25 microlitros de acetato de magnésio 280 milimolar. Misture bem e incube a 39 graus Celsius por 20 minutos. Após a incubação, adicione cinco microlitros do produto da reação à solução B e misture. Colocar as amostras num instrumento de PCR quantitativo de fluorescência. Defina o canal para FAM e leia o sinal fluorescente a cada minuto a 39 graus Celsius por um total de 60 minutos. Para avaliação da sensibilidade da plataforma de detecção baseada em RPA-CRISPR CAST12a, use um plasmídeo recombinante positivo diluído em concentrações que variam de uma a 10⁷ cópias por microlitro como modelo para a reação. Use a água como controle negativo. Transfira o plasmídeo para a solução A, adicione acetato de magnésio e incube conforme demonstrado anteriormente. Após incubação e transferência para a solução B, ler o sinal fluorescenteAl. O par de primers F3-R3 foi identificado como o mais eficaz para amplificação da polimerase recombinase, exibindo as bandas mais brilhantes e densas na eletroforese em gel de agarose. A concentração ideal de primer para amplificação foi determinada em 0,44 micromolar e o tempo de reação ideal foi de 20 minutos. A intensidade de fluorescência do CRISPR RNA1 aumentou ao longo do tempo, enquanto o CRISPR RNA2 não, levando à seleção do CRISPR RNA1 para detecção de A. baumannii. A análise de especificidade confirmou que o sistema detector de A. baumannii detectou exclusivamente DNA de A. baumannii, sem fluorescência observada para outras amostras de DNA bacteriano. O sistema pode detectar apenas uma cópia por microlitro de DNA, tornando-o altamente sensível. O ensaio de faixa de fluxo lateral confirmou a alta especificidade do método de detecção, não mostrando reatividade cruzada com outras espécies bacterianas. O ensaio de A. baumannii detectou com sucesso DNA em diluições de 10⁷ cópias por microlitro até uma única cópia por microlitro, confirmando sua robustez sob luz ultravioleta.