Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca²⁺ via estimulação óptica não genética

A pesquisa visa avançar em modelos microfisiológicos cardíacos in vitro, integrando métodos de fotoestimulação baseados em materiais. Ele se concentra na superação de limitações na longevidade e invasividade da estimulação, fornecendo ferramentas confiáveis para estudar a fisiologia cardíaca, melhorar os processos de triagem de medicamentos e promover aplicações na modelagem de doenças. Os recentes avanços na bioestimulação alavancam, como para controle celular não invasivo preciso.

A optogenética permite que a modificação genética regule a atividade celular, enquanto os fototransdutores emergentes baseados em materiais oferecem alternativas não genéticas. Essa inovação fornece um avanço significativo no estudo e modulação de neurônios, cardiomiócitos e células musculares esqueléticas em diversas aplicações. Os desafios experimentais atuais incluem alcançar o fornecimento consistente de luz aos tecidos profundos, otimizar a biocompatibilidade e a estabilidade dos fototransdutores e melhorar a precisão das técnicas de estimulação baseadas em luz.

Além disso, a integração desses métodos com sistemas biológicos complexos, mantendo a viabilidade e a funcionalidade celular, continua sendo um obstáculo importante. Este protocolo aborda a lacuna de pesquisa da necessidade de técnicas de estimulação precisas não invasivas em modelos microfisiológicos cardíacos. Ao usar fototransdutores baseados em materiais, como o Ziapin2, essa abordagem supera as limitações da estimulação elétrica tradicional e da optogenética, oferecendo contorno temporal e espacial aprimorado, preservando a viabilidade e a função do tecido.

Minhas descobertas avançarão na pesquisa ao introduzir uma técnica de estimulação de luz não invasiva baseada em material que oferece maior precisão e controle sobre a atividade celular nos tecidos cardíacos. Essa abordagem elimina a necessidade de modificações genéticas, fornecendo uma ferramenta versátil para modelar a função cardíaca, estudar os mecanismos da doença e desenvolver estratégias terapêuticas mais eficazes. Para começar, cole duas camadas de fita adesiva de laboratório, uma branca e outra azul, em uma folha de acrílico transparente, resistente a arranhões e ultravioleta de um milímetro de espessura.

Corte o padrão de chip na fita de acordo com o design pretendido e, em seguida, usando um gravador a laser de dióxido de carbono, corte a folha de acrílico em círculos. Remova as duas camadas de fita dentro da linha mais interna usando uma pinça. Mergulhe os cavacos em alvejante puro por 30 minutos a uma hora para remover linhas grossas e manchas escuras do corte, deixando uma linha afiada, e enxágue os cavacos em um béquer com água deionizada corrente durante a noite ou por pelo menos três horas.

Sonicate os chips por 10 minutos nos selos de polidimetilsiloxano, ou PDMS, com características de ranhura de linha por 30 minutos em etanol limpo a 70%. Transfira as fichas e carimbos para uma área limpa sob um capô e deixe-os secar sob fluxo de ar por aproximadamente uma a duas horas. Em seguida, sonice a gelatina recém-preparada por 15 minutos e, em seguida, coloque-a de volta no banho-maria a 65 graus Celsius até que esteja pronta para uso.

Coloque a transglutaminase microbiana, ou tubo MTG, em um dessecador com a tampa ligeiramente solta e ligue lentamente o aspirador para remover as bolhas. Após a desgaseificação, retorne o tubo MTG ao banho-maria de 37 graus Celsius. Em seguida, cubra uma folha de grade com Parafilm limpo e coloque os chips na grade.

Mantenha o carimbo PDMS por perto para uso. Adicione cinco mililitros de MTG a cinco mililitros da solução de gelatina, pipetando cuidadosamente para evitar bolhas. Agora, alíquota rápida de aproximadamente 0,5 mililitros da mistura de gelatina em cada chip, garantindo que a mistura cubra a área do chip.

Coloque o carimbo PDMS com padrão de linha no topo e aplique um peso de 200 gramas para garantir que a gelatina seja padronizada paralelamente ao eixo longitudinal do tecido. Depois que todos os chips estiverem moldados, cubra-os com uma jarra de vidro para evitar distúrbios ambientais e deixe-os reticular durante a noite. Transfira o chip e o carimbo PDMS ensanduichado para um novo prato P150 cheio de PBS para hidratar a gelatina por 30 minutos a uma hora para facilitar a separação do carimbo PDMS do chip.

Depois de remover qualquer excesso de gelatina desenforme ao redor do chip, transfira o chip limpo para um novo prato P150 cheio de PBS. Armazene os carimbos PDMS em etanol 70%. Para esterilizar os chips, mergulhe-os em etanol por 10 minutos sob o capô.

Transfira os chips para PBS, deixe-os de molho por 10 minutos, seguido de uma lavagem de PBS três vezes. Para as soluções de revestimento, misture 20 microgramas por mililitro de fibronectina com uma diluição de um a 100 de Geltrex em meio de cultura sem suplemento. Cubra os chips com esta solução por duas horas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Descongele e semeie cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em meio RPMI contendo 10 micromolares Y-27632. Substitua o meio por RPMI desprovido de Y-27632 após 24 horas. Três dias após a semeadura das células, use uma pinça para remover cuidadosamente a fita branca dos chips.

Preparar o aparelho de cartografia óptica constituído por um microscópio de lente tandem modificado equipado com uma câmara de alta velocidade e uma lâmpada de mercúrio de 200 miliwatts como fonte de luz de excitação. Coloque um espelho dicróico na frente da câmera de imagem de cálcio designada. Para estimulação óptica, aplique estimulação de ponto óptico em uma extremidade do tecido usando uma fonte de luz LED para estimular o Ziapin2, o fototransdutor.

Estimule os tecidos a uma frequência de 0,5, ou um hertz, por meio de uma fibra óptica regulada temporalmente posicionada a um milímetro de distância do tecido. Incubar a amostra com dois X-Rhod-1 micromolares adicionados ao meio de cultura por 30 minutos a 37 graus Celsius. Depois de lavar os chips com meio de cultura fresco, transfira-os para o meio RPMI 1640 sem vermelho de fenol, suplementado com B-27 menos insulina e HEPES.

Coloque as fichas de tecido em um prato com temperatura controlada ajustada para temperatura fisiológica e inicie as gravações a uma taxa de quadros de 2,5 quadros por segundo. A propagação da onda de cálcio foi visualizada com sucesso, com uma resolução espacial e temporal clara durante a fotoestimulação em frequências de 0,5 ou um hertz, com velocidades de condução calculadas em aproximadamente 4,5 centímetros por segundo, consistentes com os valores fisiológicos. Os parâmetros transitórios de cálcio, incluindo amplitude, tempo de subida, decaimento máximo, inclinação e tempo de decaimento, foram quantitativamente semelhantes entre a estimulação luminosa e a estimulação elétrica, confirmando respostas funcionais comparáveis.