Name: O branqueamento iterativo amplia a multiplicidade com o uso da automação de coloração para instalações principais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: Aprenda o método IBEX para neurociência usando coloração automatizada de tecidos. Esta técnica com amplificação de sinal por tiramida melhora a qualidade da imagem e a reprodutibilidade dos resultados experimentais.

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<ol><li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+an+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nature Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Prichard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+automated+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Overview of automated immunohistochemistry.</a> Arch Pathol Lab Med. 138, 1578-1582 (2014).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70, 46-58 (2014).</li>
<li>Speranza, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+immune+dynamics+during+SARS-CoV-2+infection+in+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in immune dynamics during SARS-CoV-2 infection in rhesus macaques.</a> Life Sci Alliance. 5, 4(2022).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+requirements+and+recommendations+for+multiplex+immunofluorescence+tyramide+signal+amplification+assays+to+support+translational+oncology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Procedural requirements and recommendations for multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification assays to support translational oncology studies.</a> Cancers (Basel). 12 (2), 255(2020).</li>
<li>Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+immunofluorescence+and+multispectral+imaging%3A+forming+the+Basis+of+a+clinical+test+platform+for+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the Basis of a clinical test platform for immuno-oncology.</a> Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7, 16878(2017).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+analysis+with+SPIAT+and+spaSim+to+characterize+and+simulate+tissue+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial analysis with SPIAT and spaSim to characterize and simulate tissue microenvironments.</a> Nat Commun. 14, 2697(2023).</li>
<li>Meyer, L., Eling, N., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cytoviewer%3A+an+R%2FBioconductor+package+for+interactive+visualization+and+exploration+of+highly+multiplexed+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">cytoviewer: an R/Bioconductor package for interactive visualization and exploration of highly multiplexed imaging data.</a> BMC Bioinformatics. 25, 9(2024).</li>
<li>Windhager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+end-to-end+workflow+for+multiplexed+image+processing+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An end-to-end workflow for multiplexed image processing and analysis.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3565-3613 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Kits TSA da Alexa reagentes para manchas </td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>Corantes alternativos da TSA se não houver filtros de microscopia de opala disponíveis. Incluem Alexa Fluor 488 (canal azul/verde), Alexa Fluor 555 ou 568 (canal vermelho), Alexa Fluor 647 (canal vermelho distante), Alexa Fluor 750 (infravermelho próximo, se equipada com filtros apropriados). &nbsp;</td></tr><tr><td>Anticorpo Arg1</td><td>Sinalização de Celular</td><td>93668</td><td>Usado na Figura 4 em 1:100</td></tr><tr><td>Material Blades</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Ou similar, o perfil alto ou baixo depende do tipo de tecido</td></tr><tr><td>Anticorpo CD11b</td><td>Abcam</td><td>ab133357</td><td>Usado na Figura 4 em 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo CD163</td><td>Abcam</td><td>ab182422</td><td>Usado na Figura 4 em 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo CD31</td><td>Sinalização de Celular</td><td>77699S</td><td>Usado na Figura 2 em 1:100</td></tr><tr><td>Anticorpo CD3e</td><td>Dako</td><td>A045201-2</td><td>Usado na Figura 1 em 1:100</td></tr><tr><td>Tool Coplin Jar</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-816-21</td><td>Ou algo semelhante</td></tr><tr><td>Cobertores Materialbr/</td><td>VWR</td><td>v48393-026</td><td>Ou algo semelhante</td></tr><tr><td>Anticorpo CX3CR1</td><td>Abcam</td><td>ab308613</td><td>Usado na Figura 4 em 1:450</td></tr><tr><td>Stain DAPI</td><td>Akoya</td><td>FP1490</td><td></td></tr><tr><td>Software FIJI</td><td></td><td></td><td>Usado para medir a intensidade do sinal</td></tr><tr><td>Slide Fisher Superfront Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-246</td><td>Ou algo parecido</td></tr><tr><td>Software HALO</td><td>Indica Labs</td><td></td><td>Exemplo de software de análise de imagem comercialmente disponível. Usado para alinhar e analisar imagens.</td></tr><tr><td>Anticorpo Iba1</td><td>Sinalização de Celular</td><td>17191</td><td>Usado na Figura 4 em 1:800</td></tr><tr><td>Software inForm</td><td>Akoya</td><td></td><td>Usado para medir a intensidade do sinal</td></tr><tr><td>Anticorpo iNOS</td><td>Abcam</td><td>ab283655</td><td>Usado na Figura 4 em 1:400</td></tr><tr><td>Instrument Leica Bond Rx (ou RXm)</td><td>Leica Biosystems</td><td>21.2201</td><td>Referido como "Autostainer 1" no texto. Certifique-se de que todos os reagentes associados também estejam disponíveis, incluindo caixas de coloração e soluções a granel.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reagent LiBH4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62460-5G-F</td><td>Manter em um ambiente anidro</td></tr><tr><td>Estalido de Mantra Instrument </td><td>Akoya</td><td></td><td>É necessário um microscópio multiespectral de fluorescência para identificar os corantes. Exemplo de microscópio que pode ser usado para detectar corantes de opala.</td></tr><tr><td>Microtomo Tool </td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Ou semelhante com acessórios preferidos, como pincéis</td></tr><tr><td>Reagente de coloração Kit Opal IHC 480</td><td>Akoya</td><td>FP1500001KT</td><td>Usado na Figura 4</td></tr><tr><td>Reagente de coloração Kit Opal IHC 6-plex Plex</td><td>Akoya</td><td>NEL821001KT</td><td>Os 520 e 620 não descolorem, usados nas Figuras 1, 2 e 4</td></tr><tr><td>Reagente de coloração Kit Opal IHC 780</td><td>Akoya</td><td>FP1501001KT</td><td>Usado na Figura 4</td></tr><tr><td>Forno Tool </td><td>Millipore Sigma</td><td>Z683329</td><td>Ou algo semelhante, também pode ser feito no autostainer</td></tr><tr><td>Anticorpo Pancitoqueratina</td><td>Abcam</td><td>ab9377</td><td>Usado na Figura 4 em 1:50</td></tr><tr><td>Reagente PBS (opcional)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61196AP</td><td></td></tr><tr><td>Instrument PhenoImager</td><td>Akoya</td><td></td><td>Imagem multiespectral de slide inteiro com desmistura espectral integrada incluída no software</td></tr><tr><td>Reagente ProLong Gold Antifade</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td>Ou meios de montagem aquosos semelhantes</td></tr><tr><td>Anticorpo ProSP-C n-terminal (ProSPC)</td><td>Biorreagentes das Sete Colinas</td><td>WRAB-9337</td><td>Usado na Figura 4 em 1:250</td></tr><tr><td>RAIVA < anticorpos/></td><td>R& D</td><td>MAB1179</td><td>Usado nas Figuras 1 e 2 em 1:50</td></tr><tr><td>Reagente Buffer de reação</td><td>Roche</td><td>NC1895692</td><td>Para uso com o autostainer Ventana</td></tr><tr><td>Anticorpo SARS-CoV-2-N</td><td>Sinalização de Celular</td><td>68344</td><td>Usado na Figura 2 em 1:1000</td></tr><tr><td>Lâminas CC de Microscópio de Adesão TOMO - WH</td><td>Avantik</td><td>SKUSL6519-1</td><td>Se a adesão do tecido for motivo de preocupação</td></tr><tr><td>Instrument Ventana Discovery Ultra</td><td>Roche</td><td></td><td>Referido como "Autostainer 2" no texto. Certifique-se de que todos os reagentes associados também estejam disponíveis, incluindo caixas de coloração e soluções a granel.&nbsp;</td></tr><tr><td>Buffer de lavagem Reagente </td><td>Leica Biosystems</td><td>AR9590</td><td>Para uso com Leica Bond autostainer</td></tr><tr><td>Reagente Água</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-230-147</td><td>DI é o melhor, não o millipore</td></tr><tr><td>Banho-maria Tool </td><td>Leica Biosystems</td><td>140607020C1</td><td>Ou algo semelhante</td></tr></tbody></table>

o branqueamento iterativo amplia a multiplicidade com o uso da automação de coloração para instalações principais

Iterative Bleaching Extends Multiplicity with Use of Staining Automation for Core Facilities

O branqueamento iterativo amplia a multiplicidade com o uso da automação de coloração para instalações principais

Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) is a highly sensitive tyramide signal amplification (TSA)-based multi-round fluorescence imaging technique ...

iterative-bleaching-extends-multiplicity-with-use-staining-automation

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Montagens genômicas baseadas em tecnologias de sequenciamento de DNA em massa paralela são geralmente altamente fragmentadas. O desenvolvimento de mapas cromossômicos físicos pode potencialmente melhorar as montagens genômicas. Aqui, demonstramos abordagens inovadoras para o preparo de cromossomos, hibridização fluorescente in situ e imageamento que aumentam significativamente o rendimento no desenvolvimento de mapas físicos.

Alta capacidade mapeamento físico de cromossomos usando Automated<em&gt; In situ</em&gt; Hibridação

Neste manuscrito, apresentamos uma plataforma de criohistologia semiautomatizada de alto rendimento para produzir imagens compostas alinhadas de múltiplas medidas de resposta de várias rodadas de imagens fluorescentes em seções congeladas de tecidos mineralizados.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

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Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Descreveremos um protocolo abrangente e prático para recuperação de fluorescência após fotobranqueamento experimentos com células vivem. Embora o protocolo foi usado para medir a mobilidade dos p62 com tag proteína fluorescente amarelo em estruturas aggresome induzidas, pode ser aplicado a uma variedade de sistemas de microscopia e proteínas fluorescentes.

Recuperação de fluorescência após p62 fotobranqueamento de amarelo fluorescente proteína marcados em Aggresome induzida por estruturas

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Este relatório descreve um protocolo automatizado para ensaios de imunofluorescência multiplex (mIF) em um corador de lâmina automatizado. Ele demonstra a alta reprodutibilidade da proteômica espacial em autocorantes de tecido padrão de alto rendimento e imageadores de fluorescência de lâmina inteira, o que é ideal para ensaios mIF personalizados em um grande número de lâminas de tecido em pesquisa translacional.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

Este artigo descreve um protocolo de imunofluorescência multiplex otimizado para caracterizar a arquitetura tridimensional de metástases peritoneais.

Imagens tridimensionais de tecido portador de tumor usando o clareamento iterativo estende a abordagem de multiplexidade

A implementação de uma técnica de fotoirradiação versátil e de baixo custo com o método IBEX manual permite imagens ideais de tecido humano com autofluorescência nativa significativa. Este protocolo detalha como obter imagens multiplexadas de lâminas inteiras de amostras clínicas arquivadas usando um microscópio invertido, reagentes amplamente disponíveis e software de código aberto para alinhamento e processamento de imagens.

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

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