Name: Abordagem transconjuntival para injeção no nervo óptico de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 2 min 33 s
Description: Aprenda a técnica transconjuntival minimamente invasiva para injeção no nervo óptico de rato. Este método permite a entrega direta de vetores virais e corantes com visualização em tempo real para pesquisa em neurofibromatose tipo 1.

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<ol><li>Korn, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+neuroprotective+effects+of+methylprednisolone+and+surgical+decompression+in+a+rodent+model+of+traumatic+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the neuroprotective effects of methylprednisolone and surgical decompression in a rodent model of traumatic optic neuropathy.</a> Curr Eye Res. 47 (3), 461-467 (2022).</li>
<li>Lim, J. Y., Utzschneider, D. A., Sakatani, K., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+attenuation+of+GABA+sensitivity+in+the+maturing+myelin-deficient+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The attenuation of GABA sensitivity in the maturing myelin-deficient rat optic nerve.</a> Brain Res Dev Brain Res. 72 (1), 15-20 (1993).</li>
<li>Singh, D., Dromel, P. C., Perepelkina, T., Baranov, P., Young, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C6+cell+injection+into+the+optic+nerve+of+long-evans+rats%3A+A+short-term+model+of+optic+pathway+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">C6 cell injection into the optic nerve of long-evans rats: A short-term model of optic pathway gliomas.</a> Cell Transplant. 29, 963689720964383(2020).</li>
<li>Schwaner, S. A., Feola, A. J., Ethier, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+optic+nerve+head+biomechanics+in+a+rat+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Factors affecting optic nerve head biomechanics in a rat model of glaucoma.</a> J R Soc Interface. 17 (165), 20190695(2020).</li>
<li>Ellouze, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+allotopic+expression+of+the+human+mitochondrial+ND4+prevents+blindness+in+a+rat+model+of+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Optimized allotopic expression of the human mitochondrial ND4 prevents blindness in a rat model of mitochondrial dysfunction.</a> Am J Hum Genet. 83 (3), 373-387 (2008).</li>
<li>Kwon, H., Park, M., Nepali, S., Lew, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-preconditioned+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells+rescue+optic+nerve+axons+via+differential+roles+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+an+optic+nerve+compression+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-preconditioned placenta-derived mesenchymal stem cells rescue optic nerve axons via differential roles of vascular endothelial growth factor in an optic nerve compression animal model.</a> Mol Neurobiol. 57 (8), 3362-3375 (2020).</li>
<li>Pang, I. H., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+for+glaucoma+retinopathy+and+optic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy.</a> J Glaucoma. 16 (5), 483-505 (2007).</li>
<li>Raykova, K., Jones, M. V., Huang, H., Hoffman, P. F., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally-invasive+Technique+for+Injection+into+Rat+Optic+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve.</a> J Vis Exp. (99), e52249(2015).</li>
<li>Hallas, B. H., Wells, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+mulitple+injections+into+the+mamallian+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Kopf+Carrier%22%5BJournal%5D)">A novel technique for mulitple injections into the mamallian optic nerve.</a> Kopf Carrier. 54, 1-10 (2000).</li>
<li>Yan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+optic+nerve+transection+in+rats%3A+A+model+established+with+a+new+operative+approach+to+assess+secondary+degeneration+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Partial optic nerve transection in rats: A model established with a new operative approach to assess secondary degeneration of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (128), e56272(2017).</li>
<li>Han, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+progenitor+cell+grafts+in+immunocompromised+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of human induced pluripotent stem cell-derived retinal progenitor cell grafts in immunocompromised rats.</a> Cell Transplantation. 31, 1-25 (2022).</li>
<li>Tang, Y., Gutmann, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+Type+1-associated+optic+pathway+gliomas%3A+Current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Manag+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis Type 1-associated optic pathway gliomas: Current challenges and future prospects.</a> Cancer Manag Res. 15, 667-681 (2023).</li>
<li>Pan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+biomimetic+polydopamine+nanocomposite+scaffold+promotes+optic+nerve+regeneration+through+modulating+inhibitory+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Implantation of biomimetic polydopamine nanocomposite scaffold promotes optic nerve regeneration through modulating inhibitory microenvironment.</a> J Nanobiotechnol. 22 (1), 683(2024).</li>
<li>Gokoffski, K. K., Peng, M., Alas, B., Lam, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-protection+and+neuro-regeneration+of+the+optic+nerve%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuro-protection and neuro-regeneration of the optic nerve: recent advances and future directions.</a> Curr Opin Neurol. 33 (1), 93-105 (2020).</li>
<li>Negishi, H., Dezawa, M., Oshitari, T., Adachi-Usami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+regeneration+within+artificial+Schwann+cell+graft+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Optic nerve regeneration within artificial Schwann cell graft in the adult rat.</a> Brain Res Bull. 55 (3), 409-419 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>4',6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9542</td><td>1:10,000 diluição, usado para colorir crioseções</td></tr><tr><td>Partículas virais AAV</td><td>Vectorbuilder</td><td>N/A</td><td>Vetor usado para injeção de nervo óptico</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Meio de Montagem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td>Usado para montar crioseções coradas</td></tr><tr><td>Soro bovino albumina&nbsp;</td><td>Research Products International Corp</td><td>9048-46-8</td><td>Usado em processo para coloração de criossecções</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 de cabra anti-rato.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>Diluição 1:1000, usado para coloração de criossecções</td></tr><tr><td>Gás isoflorano</td><td>Primal Healthcare</td><td>66794-017-10</td><td>Gás para anestesia</td></tr><tr><td>Sistema de microscópio confocal vertical Leica TCS SPE&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td>Microscópio confocal</td></tr><tr><td>Seringa Luer lock</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Seringa para injeção</td></tr><tr><td>Microm HM505E criostato&nbsp;</td><td>Microm</td><td>M-HM360 fom Marshall Scientific</td><td>Usado para seccionamento de amostras</td></tr><tr><td>Ratazana anti-GFP&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>338002</td><td>diluição 1:500, usada para coloração de criossecções</td></tr><tr><td>Gancho da medula espinhal</td><td>F.S.T</td><td>10162-12</td><td>Gancho usado para isolar o nervo óptico</td></tr><tr><td>Seringa de dez microlitros Seringa</td><td></td><td>Hamilton CAL 803901</td><td>para injeção</td></tr><tr><td>Agulha de trinta e três calibres</td><td>JBP</td><td>JBP3308B</td><td>Agulha para injeção</td></tr><tr><td>Composto Tissue-Tek OCT&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>25608-930</td><td>Utilizado para o processamento de criomolduração</td></tr><tr><td>Pinça dentada</td><td>Bausch and Lomb</td><td>E1809</td><td>Pinça para agarrar a conjuntiva</td></tr><tr><td>Tesoura de tenotomia curva Westcott</td><td>Bausch and Lomb</td><td>E3323-R</td><td>Tesoura para criar peritomia</td></tr></tbody></table>

abordagem transconjuntival para injeção no nervo óptico de rato

Transconjunctival Approach for Injection into the Rat Optic Nerve

Os resultados experimentais representativos usando esta técnica para injeção de nervo óptico em ratos são mostrados na Figura 2. Neste exemplo, o vírus adeno-associado eGFP (AAV-eGFP) foi injetado no nervo óptico de rato usando a técnica transconjuntival descrita acima com uma agulha de 33 G conectada a uma seringa de 10 μL. Esses resultados fizeram parte de um experimento usando essa técnica para estudar a injeção do nervo óptico como parte de um objetivo final de usar AAV para fornecer correção CRISPR aos nervos ópticos em um modelo de rato de neurofibromatose 1 (NF1). Uma combinação de corante e vetor AAV foi usada para desenvolver a técnica de injeção. Os animais foram sacrificados sete dias após a injeção no nervo óptico. Os nervos foram então dissecados e marcados com anticorpos anti-GFP para permitir a imagem do nervo óptico com microscopia confocal para confirmar que o material havia penetrado com sucesso na bainha do nervo óptico e entrado no nervo óptico. A introdução bem-sucedida do material no nervo óptico foi confirmada pela coloração de anticorpos, e apareceu verde na microscopia confocal, como visto na Figura 2A. Nos casos em que a penetração através da bainha do nervo óptico não foi completa, ou houve efluxo de material do trajeto da agulha, a coloração foi observada ao longo da borda da bainha do nervo óptico e não dentro do tecido nervoso, como visto na Figura 2C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig01.jpg"> 
Figura 1: Sequência dos passos cirúrgicos. (A) A conjuntiva é agarrada com pinça dentada e tesouras de Westcott são usadas para criar uma peritomia límbica. (B) Depois que a fáscia da espiga é aberta e dissecada sem corte, a órbita é exposta com a ajuda de uma tesoura Westcott. (C) Um gancho da medula espinhal é inserido e usado para isolar o nervo óptico. (D) Após a dissecção romba do tecido orbital sobrejacente, o nervo óptico é exposto usando o gancho da medula espinhal. (E) Uma agulha de 33 G é usada para perfurar a bainha do nervo óptico e injetar adenovírus ou corante no nervo óptico. (F) O globo é reposicionado na órbita e a conjuntiva é reposicionada sobre o local da peritomia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68048/68048fig02.jpg"> 
Figura 2: Imagem panorâmica confocal fluorescente representativa do nervo óptico de rato 7 dias após a injeção bem-sucedida com AAV-eGFP (verde) na qual o vetor transduziu neurônios próximos ao quiasma óptico. (A) Os núcleos do nervo óptico são marcados com DAPI (azul). ONH com seta denota a cabeça do nervo óptico ou extremidade orbital do nervo, enquanto a extremidade do quiasma óptico é rotulada como "quiasma". (B) Fotografia de um nervo óptico de rato da órbita ao quiasma embutido em bloco de criossecção congelado. O nervo é injetado com tinta nanquim imediatamente posterior à órbita (local de injeção indicado pela seta preta) para orientar o nervo óptico. (C) Imagem fluorescente panorâmica do nervo óptico de rato 7 dias após a injeção malsucedida com AAV-eGFP (verde) na qual a maior parte da suspensão do vetor provavelmente efluiu para fora do trato nervoso, transduzindo a bainha óptica. Os núcleos do nervo óptico são marcados com DAPI (azul). ONH denota a cabeça do nervo óptico imediatamente posterior à retina neural e ao local da injeção indicado por uma seta branca. Quiasma e seta branca demarcam em direção ao quiasma óptico. Barras de escala = 400 μm em (A) e 200 μm em (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68048/68048fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Variável</td>
			<td colspan="3">Aproximação</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Transconjuntival</td>
			<td>Superior</td>
			<td>Lateral</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incisão na pele</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incisão conjuntival</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Não</td>
			<td>Não</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscópio</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transsecção do músculo orbital superior</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Não</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutura de tração</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gancho da medula espinhal</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Não</td>
			<td>Não</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutura de pele</td>
			<td>Não</td>
			<td>Sim</td>
			<td>Sim</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Comparação com técnicas publicadas anteriormente para isolar o nervo óptico de rato para estudo experimental. Variáveis, incluindo a necessidade de incisão na pele, incisão conjuntival, microscópio cirúrgico, transecção do músculo orbital superior, sutura de tração, gancho da medula espinhal e sutura da pele, são comparadas usando as abordagens transconjuntival, superior e lateral.

Abordagem transconjuntival para injeção no nervo óptico de rato

The rat serves as an important model for studying disorders of the optic nerve, including heritable, traumatic, neoplastic, and autoimmune conditions. ...

transconjunctival-approach-for-injection-into-the-rat-optic-nerve

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Injeção intravítrea é uma técnica amplamente utilizada na pesquisa em ciências visuais para doenças oculares ou como a aplicação direta do tratamento local. Este vídeo demonstra um protocolo para a injeção intravítrea usando uma seringa de 1ml com vidro pipeta. Dicas úteis sobre como evitar sangramento maciço e danos lentes são dadas.

Injeção intravítrea para o Estabelecimento de Modelo de Doenças Ocular

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.

Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Este vídeo demonstra a indução do glaucoma em um rato anestesiado pela injeção de solução salina hipertônica na veia episcleral. A solução salina entra na malha trabecular através do canal de Schlemm, causando cicatrizes nos tecidos, que bloqueiam a saída do humor aquoso e aumentam a pressão intraocular. A pressão elevada danifica as células ganglionares da retina, levando ao glaucoma.

Uma técnica de injeção de solução salina hipertônica para induzir glaucoma em ratos

A injeção direta no nervo óptico do rato é útil para a pesquisa regenerativa. Demonstramos uma técnica minimamente invasiva para injeção direta em um nervo óptico de rato que não envolve a abertura do crânio. Usando este método, as complicações cirúrgicas são minimizadas e a recuperação é mais rápida.

Técnica minimamente invasiva para a injeção em Rat Optic Nerve

O relatório a seguir descreve como replicar o modelo de roedor de neuropatia óptica isquêmica anterior não arterítica (rNAION), usando os parâmetros apropriados de corante, lente de contato e laser. Também revelamos as etapas apropriadas para avaliar a lesão de RNAion in vivo.

O modelo de roedor de nonarterítica óptica isquêmica anterior Neuropatia (rNAION)

As injeções sub-retinianas são a técnica mais comum para administrar grandes agentes terapêuticos, como proteínas e vetores virais, aos fotorreceptores e ao epitélio pigmentar da retina. Um método alternativo em camundongos que atinge com sucesso o espaço sub-retiniano com danos colaterais mínimos e tempos de recuperação rápidos é descrito aqui.

Um método de injeção Alternativa e validado para acessar o espaço sub-retiniano<i&gt; via</i&gt; Uma abordagem transcleral Posterior

Este protocolo tem como objetivo demonstrar uma via de administração venosa reprodutível que possa ser utilizada em ratos e camundongos durante todo o período neonatal. Esse procedimento é importante para estudos pré-clínicos com roedores que desejam espelhar a administração de medicamentos em unidades neonatais, principalmente por via intravenosa.

Modelo Neonato de Injeção de Veias Retroorbitárias em Roedores

Este protocolo descreve uma técnica para injeção intracameral em ratos usando uma incisão central na córnea e um longo túnel na câmara anterior. Este método de injeção minimiza o risco de induzir danos inadvertidos ao tecido e, assim, melhora a precisão e a reprodutibilidade.

Injeção intracameral em ratos com baixo risco de efeitos adversos

Este artigo descreve métodos para injeção sub-retiniana em ratos, utilizando visualização intraoperatória para controlar o local da injeção e a área de descolamento de retina.

Visualização intraoperatória de injeção sub-retiniana e descolamento de retina em ratos

Este estudo apresenta uma metodologia para a administração de terapêutica na retina e nos nervos ópticos do rato adulto. Além disso, um método exclusivo de recuperação de tecido é introduzido para uma coleção em bloco de cima para baixo do nervo óptico e da retina em um rato adulto.

Entrega terapêutica ocular e recuperação avançada de tecidos em ratos adultos

Aprenda a técnica transconjuntival minimamente invasiva para injeção no nervo óptico de rato. Este método permite a entrega direta de vetores virais e corantes com visualização em tempo real para pesquisa em neurofibromatose tipo 1.

Abordagem transconjuntival para injeção no nervo óptico de rato

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