In vivo Imagens revelam o comportamento migratório dos leucócitos dentro das articulações

Como as células ósseas do sangue dos leucócitos derivam da medula óssea, elas precisam entrar no tecido para causar inflamação. O controle desse processo representa um ponto-chave em que novas terapias podem ser desenvolvidas para atenuar a inflamação. Em geral, o tráfego de leucócitos para tecido inflamado ocorre em vênulas pós-capilares e segue a cascata de adesão, que começa com a captura de leucócitos em fluxo livre pela parede do vaso.

Em seguida, rolam ao longo da parede do recipiente na direção pro. Parada no endotélio. Portanto, há adesão e rastejamento em todas as direções na superfície do vaso para localizar um local respectivo para a migração transendotelial para um local específico dentro do tecido.

Provocando inflamações. Esses passos distintos são regulados pela combinação de sinais moleculares, incluindo os quimioatrativos. O quimioatrativos ativa leucócitos via ZP Cs e desempenha papéis críticos na cascata migratoria.

Portanto, estudos adicionais de desfechos e experimentos in vitro não forneceram insights sobre como o quimioatraente e a sinalização dos receptores quimioatrativos regulam dinamicamente o comportamento migratório de leucócitos in vivo. Assim, avanços recentes na tecnologia de imagem proporcionaram visões sem precedentes sobre a migração de células imunes em animais vivos, ampliando muito nossa compreensão da regulação molecular do tráfico celular imunológico in vivo. Recentemente, solicitamos investigação do mecanismo molecular que controla o tráfego de neutrófilos para locais de inflamações articulares.

Então, nossa imagem articular in vivo, eles constroem esse novo paradigma em reações de hipersensibilidade tipo III dentro da articulação. Assim, nosso componente complementar C5a atua como iniciador da inflamação, enquanto as células residentes no tecido desempenham papéis mais significativos na inflamação no paradigma atual das reações de hipersensibilidade tipo III. Portanto, a imagem in vivo da articulação é uma técnica valiosa para descobrir o comportamento migrado dos leucócitos e a dinâmica molecular da articulação inflamada.

Por isso, estamos compartilhando este protocolo para imagens articulares in vivo para apoiar grupos de pesquisa que estudam esse processo em articulações inflamadas. Prepare o colágeno bovino tipo II de diluição em ácido acético molar 0,05 agitando durante a noite a quatro graus para criar a mistura de emulsão diluindo colágeno com adjuvante Freund completo em proporção 1:2 em uma seringa de vidro. Também podia ser misturado à mão por aproximadamente 20 minutos.

Esse processo gera calor, então resfrie a seringa de vidro contendo emulsão sobre gelo. Um camundongo anestesiado antes das imunizações. Modele os pelos ao longo da cauda usando uma máquina de cortar para preparar a imunização.

Injete lentamente um volume de 100 microlitros da emulsão no espaço subcutâneo próximo à base da cauda. A pontuação clínica da artrite e a medição da espessura das patas são essenciais para avaliar a atividade da doença. Normalmente, a pontuação clínica da artrite e as medições da espessura das patas são feitas a cada um a três dias após as primeiras imunizações.

A pontuação clínica da artrite para essa pontuação é a soma das pontuações das quatro patas de cada camundongo. As pontuações são registradas da seguinte forma. Então, zero é anormal.

Um deles é eritema e inchaço de um dedo. O segundo é o eritema e o inchaço de dois dedos ou eritema e inchaço da articulação do tornozelo. Três é eritema e inchaço de mais de três dedos ou inchaço de dois dedos e articulação do tornozelo.

Quatro é eritema e inchaço severo do tornozelo, pé e dedo com deformidade. Assim, a medição da espessura das patas é medida a espessura de cada pata usando pinças digitais de deslizamento. A espessura média das patas em todas as quatro patas é usada para cada rato.

Os ratos são anestesiados e então moldam a perna do rato com uma máquina de cortar a linha. Use creme depilador para remover qualquer pelo restante. Remova o creme com gaze úmida.

Aplique lubrificante corneano estéril em ambos os olhos para evitar o ressecamento corneano e reduzir o risco de oscilação corneana. Sob um endoscópio cirúrgico, faça uma incisão de um centímetro ao longo da pele usando uma microtesoura. Cubra a imagem anteriormente com 1,5% de agarose e PBS.

O palco está montado no microscópio. Ajuste as configurações do microscópio confocal, incluindo potência do laser, ganho, deslocamento e localização. Uma vez identificada a localização adequada, inicie a aquisição de imagem.

Um resultado representativo da CIA. Normalmente, o início da artrite é observado no dia 28, com o escore clínico da artrite e a espessura das patas atingindo o pico ao longo do dia 35. A incidência de CIA em camundongos DBA de 1 dia geralmente ultrapassa 900 a 100% no dia 35.

Aqui, o filme à esquerda mostra a articulação em camundongos de controle e a da direita mostra a articulação em ratos da CIA. Nesses filmes, as células verdes representam neutrófilos positivos para Ly6G. As células laranja indicam células T CD4 positivas, e as áreas brancas correspondem aos vasos sanguíneos.

No dia 35, é possível ver claramente que há mais neutrófilos positivos para Ly6G fora dos vasos sanguíneos em comparação com células T CD4+. Esses neutrófilos são altamente móveis, movendo-se ativamente em múltiplas direções dentro da articulação inflamada. Aqui, estou mostrando a análise representativa da imagem in vivo das articulações.

O gráfico à esquerda mostra o número de neutrófilos recém-colados, enquanto o da direita mostra o número de neutrófilos recém-transmigrados durante uma gravação de 30 minutos. Nas articulações artríticas, o número de neutrófilos recém-colados e transmigrados é significativamente maior do que os observados nas articulações de controle. Em conclusão, apresentamos nosso protocolo atual para imagem in vivo das articulações, que permite visualização em tempo real e de alta resolução do comportamento migratório de leucócitos em camundongos vivos sob condições fisiológicas e patológicas.

Essa técnica nos permite observar diretamente como as células imunes interagem dentro dos tecidos inflamados, como elas aderem às paredes dos vasos sanguíneos, transmigram para o tecido e orquestram a resposta inflamatória. Por meio dessa abordagem, podemos capturar comportamentos celulares dinâmicos que seriam invisíveis com métodos histológicos ou in vitro convencionais. Ao combinar esse sistema de imagem com análise quantitativa e marcadores moleculares, conseguimos descobrir caminhos-chave que impulsionam a iniciação e progressão da artrite.

Importante destacar que os insights obtidos dessas observações in vivo não apenas aprofundam nossa compreensão da dinâmica das células imunes, mas também fornecem uma base científica ou para identificar novos alvos terapêuticos. À medida que essa tecnologia continua a evoluir, e à medida que mais pesquisadores adaptam e refinam a metodologia, acreditamos que a imagem in vivo se tornará uma plataforma essencial para estudar doenças complexas mediadas pelo sistema imunologico e uma poderosa brecha que conecta a imunologia básica à pesquisa translacional e clínica. Em última análise, esperamos que essa abordagem contribua para o desenvolvimento de terapias inovadoras para artrite reumatoide e outras doenças inflamatórias crônicas em um futuro próximo.