In Ovo Xenoenxerto de células de leucemia linfoblástica aguda (LLA) derivadas de pacientes (PDX-LLA)

O escopo desta pesquisa é a biologia do câncer, com foco na identificação de estratégias terapêuticas para o tratamento do câncer. O modelo de leucemia linfoblástica aguda de xenoenxerto derivado de paciente in ovo é limitado por uma janela experimental relativamente curta de cerca de 10 dias, limitando estudos de longo prazo sobre a progressão da leucemia linfoblástica aguda ou resposta a medicamentos além desse período. Este protocolo estabelece um método rápido e econômico para xenoenxerto in ovo de células de leucemia linfoblástica aguda derivadas de pacientes, incluindo linhagens de células B e T.

Este protocolo representa uma ferramenta promissora para triagem pré-clínica de drogas, estudos mecanicistas e abordagens de medicina potencialmente personalizadas na pesquisa de leucemia. A viabilidade de usar o modelo de xenoenxerto in ovo estabelecido para aplicações pré-clínicas será explorada. Para começar, transfira os ovos adquiridos para uma incubadora umidificada com aproximadamente 50 a 60% de umidade e uma temperatura de 39 graus Celsius.

Incube os ovos nesta incubadora por 10 dias após a fertilização. Transfira as amostras de sangue para um tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros e dilua cada amostra três vezes usando dois volumes de PBS. Depois de centrifugar a amostra junto com um meio de gradiente de densidade, colete a camada de revestimento leucocitário de células mononucleares da interface e transfira-a para um novo tubo estéril de 15 mililitros.

Adicione 10 mililitros de PBS ao tubo e centrifugue os tubos a 300 G por cinco minutos para remover os componentes restantes do soro. Ressuspenda as células peletizadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS. Use um hemocitômetro para contar o número de células.

Ressuspenda as células em meio de congelamento consistindo de 10% de DMSO em FBS. Avalie a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão de azul de tripano e congele as células a menos 80 graus Celsius e armazene-as em nitrogênio líquido. Em seguida, co-transfecte 1,5 milhão de células T HEK 293 com o vetor de plasmídeo desejado usando Lipofectamine 3000 e incube as células transfectadas por dois dias.

Colha o sobrenadante contendo lentivírus dos poços e filtre-o através de um filtro de 0,45 micrômetro para remover os detritos. Transferir o sobrenadante viral filtrado para tubos de centrifugação e centrifugar a 20 000 G durante duas horas a quatro graus Celsius. Para rotulagem, coloque 1 milhão de células por mililitro de linhagens celulares SEM precursoras de células B e MOLT3 de células T, bem como células de leucemia linfoblástica aguda B ou T derivadas de pacientes em placas de seis poços contendo RPMI 1640 com 10% FBS.

Visualize células marcadas com mCherry sob um microscópio de fluorescência. No dia 10, examine a vasculatura dos embriões de pintinho sob luz para avaliar a viabilidade do embrião, lave suavemente a superfície de cada ovo com etanol a 70%. Usando uma furadeira manual, perfure a célula de ar de cada ovo para criar uma pequena janela de aproximadamente dois centímetros de diâmetro.

Sele a janela criada com fita adesiva transparente e devolva os ovos a uma incubadora de 5% de dióxido de carbono. No dia 11, injete 10 milhões de células de leucemia linfoblástica aguda marcadas com mCherry nos vasos sanguíneos dos embriões em desenvolvimento usando agulhas de calibre 34. Depois de selar a janela, retorne os ovos para uma incubadora de dióxido de carbono a 5% e monitore a viabilidade do embrião diariamente.

No dia 15, disseque os vasos sanguíneos dos embriões. Coloque-os em lâminas de vidro e fotografe xenoenxertos bem-sucedidos usando um microscópio de dissecação equipado com recursos de fluorescência. Colete sangue da vasculatura de embriões de galinha usando uma seringa estéril com uma agulha de calibre 32.

Transfira o sangue para um tubo estéril de 1,5 mililitro contendo heparina e centrifugue a 226 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Rotule células de leucemia linfoblástica aguda de células B com anticorpos FITC CD10 humano e PE CD19 humano e células de leucemia linfoblástica aguda de células T com anticorpos FITC CD4 humano e PE CD8 humano a quatro graus Celsius no escuro por 30 minutos. Lave as células marcadas duas vezes usando PBS contendo 1% de BSA e analise usando citometria de fluxo A colonização vascular por linhagens celulares SEM e MOLT3 foi claramente visível quatro dias após a injeção, confirmando o enxerto bem-sucedido na vasculatura do embrião de galinha em desenvolvimento.

As células B-all e T-all derivadas do paciente mostraram fortes sinais fluorescentes nos vasos sanguíneos quatro dias após a injeção, indicando colonização ativa e proliferação na vasculatura. A citometria de fluxo revelou um aumento significativo de células CD10 / CD19 positivas em embriões injetados com MEV e células B-all derivadas do paciente quatro dias após a injeção em comparação com os controles coletados seis horas após a injeção. Da mesma forma, as células CD4 / CD8 positivas foram significativamente maiores em embriões injetados com MOLT3 e células T-all derivadas do paciente quatro dias após a injeção.