Estabelecendo modelos in vitro de cultura de gânglios da raiz dorsal: abordagens complementares para investigar a diafonia câncer-nervo

Nossa pesquisa se concentra na diafonia câncer-nervo, usando gânglios da raiz dorsal 3D ou explantes DRG e culturas dissociadas 2D para quantificar a migração tumoral neuroguiada e testar estratégias moleculares para limitar sua interação. Com este protocolo, estabelecemos culturas DRG 3D e 2D complementares, otimizamos o crescimento de neuritos e demonstramos um aumento na invasão de células cancerígenas ao longo das extensões de neuritos. Abordamos a falta de modelos reprodutíveis que capturam interações intrincadas em nível de célula e arquitetura nervosa intacta, criando culturas DRG 2D e 3D complementares a partir de um único camundongo.

Nosso protocolo produz explantes 3D emparelhados e culturas de neurônios 2D de um único camundongo, preservando a textura angular, permitindo imagens de alto conteúdo, reduzindo o uso de animais e permitindo obter dados em nível de tecido e de célula única em um experimento. Nosso modelo abriu questões sobre quais fatores criados pelo DRG impulsionam a invasão, como a atividade dos neurônios, a idade e o genótipo a moldam e se o direcionamento de receptores de fatores neurotróficos pode diminuir a disseminação do câncer guiado por neuritos. Para começar, coloque um rato sacrificado em seu abdômen.

Raspe o pelo, concentrando-se na área sobre a coluna vertebral para expor a superfície dorsal. Pulverize 70% de etanol sobre o dorso do animal. Usando toalhas de papel, limpe da cauda ao crânio para remover qualquer pelo solto e evitar contaminação durante a dissecação.

Com uma tesoura esterilizada, faça uma incisão reta ao longo da linha média dorsal da cauda ao crânio. Usando uma pinça romba, retraia a pele em ambos os lados da incisão para expor a coluna vertebral. Agora, use uma tesoura e uma pinça novas para evitar contaminação e faça uma incisão horizontal na extremidade da coluna vertebral.

Em seguida, faça duas incisões longitudinais paralelas em ambos os lados da coluna vertebral para liberá-la. Use uma pinça para levantar suavemente a coluna vertebral e remover o tecido conjuntivo circundante. Para liberar totalmente a coluna vertebral, faça uma incisão na parte superior da coluna vertebral perto do crânio.

Transfira a coluna vertebral para uma placa pré-resfriada de 10 centímetros contendo HBSS com penicilina estreptomicina mantida em gelo. Em seguida, use uma tesoura de mola para remover qualquer tecido conjuntivo remanescente da coluna vertebral e expor as vértebras. Transfira a coluna vertebral aparada para um microscópio stage.

Divida cuidadosamente a coluna ao longo do plano sagital usando uma tesoura de mola. Usando uma pinça de ponta fina, remova a medula espinhal da coluna para revelar os gânglios da raiz dorsal ao longo das raízes dos nervos espinhais. Corte os nervos espinhais usando uma tesoura de mola.

Em seguida, remova qualquer tecido conjuntivo circundante dos gânglios da raiz dorsal. Usando uma pinça de ponta fina, extraia suavemente os gânglios da raiz dorsal das raízes dorsais. Para cultura de montagem inteira, coloque os DRGs em uma placa de três centímetros contendo HBSS com estreptomicina de penicilina mantida em gelo.

Use ponteiras de pipeta pré-resfriadas para dispensar dois microlitros de Matrigel resfriado em cada poço de uma lâmina de fundo de vidro de oito poços colocada dentro de uma placa de 10 centímetros no gelo. Para evitar a polimerização prematura, pipete apenas uma gota de cada vez. Em seguida, use uma pinça de ponta fina para colocar um gânglio da raiz dorsal em uma placa seca.

Gire suavemente para remover o excesso de HBSS. Em seguida, transfira o gânglio da raiz dorsal limpo para a gota Matrigel. Depois de transferir todos os gânglios para as gotículas, incube a lâmina com fundo de vidro em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius por cinco minutos para permitir que o Matrigel polimerize.

Em seguida, adicione cuidadosamente 200 microlitros de meios de cultura suplementados quentes a cada poço. Incube a lâmina a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Use microscopia de campo claro para monitorar os gânglios da raiz dorsal diariamente quanto ao crescimento e viabilidade neuronal.

Centrifugue um tubo cônico de 15 mililitros contendo gânglios da raiz dorsal agrupados a 200G por cinco minutos em temperatura ambiente. Depois de pipetar o HBSS, enxágue os gânglios com meio suplementado pré-aquecido e bata suavemente. Em seguida, centrifugue o tubo por cinco minutos a 200G para pellet os DRGs.

Substitua a mídia por um mililitro de solução de papaína. Misture delicadamente e incube a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos por 20 minutos, agitando suavemente a cada cinco minutos. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio suplementado para neutralizar a papaína e misture delicadamente.

Centrifugue por cinco minutos a 400G para peletar os gânglios da raiz dorsal. Depois de pipetar o sobrenadante, adicione um mililitro de colagenase tipo IV na solução de Dispase II e incube novamente. Adicione 4,5 mililitros de meio suplementado para neutralizar a solução enzimática, misture delicadamente e centrifugue.

Depois de pipetar o sobrenadante, adicione cinco mililitros de meio suplementado. Em seguida, adicione Dnase I para atingir uma concentração final de 0,2 miligramas por mililitro. Os gânglios da raiz dorsal agora devem aparecer como um aglomerado solto, indicando digestão completa.

Para dissociação mecânica, use uma ponta de pipeta de filtro de 1.000 microlitros para triturar a solução de gânglios pipetando para cima e para baixo quatro a cinco vezes. Mude para uma ponta de pipeta de 200 microlitros e repita a trituração pipetando quatro a cinco vezes. Filtre a suspensão turva resultante através de um filtro de células de 70 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.

Em seguida, enxágue gradualmente o filtro com 10 mililitros de meio para garantir a transferência completa das células. Centrifugue a suspensão de células filtradas por cinco minutos a 1.000 G para granular as células. Remova o meio do pellet e ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de meio suplementado.

Remova qualquer PBS residual dos poços da lâmina de fundo de vidro de oito poços. Distribua a suspensão dissociada dos gânglios da raiz dorsal nos poços revestidos de colágeno e incuba. Use microscopia de campo claro para monitorar diariamente as células derivadas dos gânglios da raiz dorsal, avaliando a viabilidade celular e o crescimento neuronal Para co-cultivar todos os gânglios do camundongo com células cancerígenas, aspire primeiro o meio das culturas DRG de montagem inteira na lâmina de fundo de vidro de oito poços.

Usando uma pipeta, adicione suavemente 200 microlitros da suspensão de células cancerígenas ao poço que contém a gotícula de Matrigel e os gânglios da raiz dorsal. Incube a lâmina de co-cultura em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Atualize a mídia diariamente lavando uma vez com 200 microlitros de mídia suplementada aquecida e adicione 300 microlitros de mídia fresca.

Para a co-cultura de gânglios dissociados e células cancerígenas, aspire o meio das culturas DRG dissociadas na lâmina de fundo de vidro de oito poços. Em seguida, distribua suavemente 200 microlitros da suspensão de células cancerígenas em cada poço antes da incubação. O estabelecimento de DRG foi menos eficiente na ausência de suplementos e a extensão de neuritos foi acentuadamente reduzida.

Os DRGs de montagem inteira de animais mais velhos produziram extensão de neuritos menos abundante e mais distinguível e células gliais mínimas, facilitando a visualização das interações das células cancerígenas nervosas. A dissociação dos neurônios DRG usando duas etapas enzimáticas resultou em maior recuperação dos neurônios. Dentro de 24 horas após a cultura, células não neuronais, como células de schwan, macrófagos e fibroblastos, tornaram-se evidentes, enquanto neuritos brotando de células derivadas de DRG foram observados e aumentaram ainda mais após 72 horas.

As células cancerígenas semeadas em inserções transwell revestidas com Matrigel invadiram as células HEC293, mas não os neurônios DRG após 24 horas de incubação. As culturas de DRG de montagem inteira imersas em uma gotícula de Matrigel permitiram a extensão do neurite para fora através da matriz em direção à periferia. Com posicionamento cuidadoso do DRG centralmente na gotícula, proporcionando extensão máxima de neurite sem crescimento excessivo das bordas.

As células cancerígenas se estabeleceram após 12 horas de co-cultura ao redor da borda da gotícula de Matrigel contendo o DRG. Após 72 horas de co-cultura, as células cancerígenas invadiram o Matrigel e se moveram em direção ao gânglio, com interação direta entre as extensões das células ganglionares da raiz dorsal e as células cancerígenas observadas. A co-cultura de células derivadas de DRG dissociadas com células cancerígenas permitiu a visualização detalhada das interações celulares individuais.