Fabricação de uma matriz cerebral expansível personalizável em diferentes estágios de desenvolvimento

Fabricação de uma matriz cerebral expansível personalizável em diferentes estágios do desenvolvimento, por Chapman e colegas da Universidade de Kentucky em Lexington, Kentucky. O desenvolvimento do cérebro do leitão é muito semelhante ao do cérebro humano em vários aspectos. Comparado a ratos e camundongos, a proporção do peso do cérebro dos leitões desde o nascimento até a maturidade é muito mais próxima da dos humanos, e as regiões funcionais dos cérebros dos leitões e dos giros e cefálicos humanos são muito semelhantes.

Por essas razões, o uso de porcos e outros grandes mamíferos na pesquisa em neurociência está aumentando. No entanto, matrizes cerebrais comerciais para mamíferos maiores são caras, e as opções frequentemente se limitam a um único tamanho ou plano de secção. Consequentemente, matrizes comerciais podem não oferecer um bom ajuste para diferentes linhas, tanto machos quanto femininas, e idades diferentes.

Isso é particularmente problemático para estudos de neurociência do desenvolvimento, nos quais o tamanho do cérebro muda significativamente com o crescimento pós-natal. Por exemplo, cérebros de leitões crescem rapidamente durante os primeiros três meses, aumentando de volume mais de três vezes. A matriz cerebral comercial de leitões foi projetada para se adaptar a cérebros de leitões apenas até duas semanas de idade.

Aqui apresentamos um método de construção de matrizes personalizável baseado em chapa acrílica como uma solução econômica e fácil de implementar para esse problema. Quatro porcos ingênuos de quatro dias de vida foram obtidos para este experimento. Um foi utilizado para coleta cerebral aos cinco dias de idade, dois aos 32 dias e um aos 38 dias.

Após a remoção do cérebro do crânio, o cérebro era fixado por imersão em formalina tamponada a 10% por dois dias e colocado em uma solução de sacarose a 30% por cinco dias para criopreservação. Em seguida, vamos apresentar como fazer um molde do cérebro usando gel de agarose. O primeiro passo para criar a matriz é fazer um molde do cérebro.

Vamos ilustrar o processo para criar um molde de um cérebro de leitão pós-natal no quinto dia, que será usado para construir uma matriz sagital. Coloque uma tira de plástico resistente no fundo do recipiente de vidro, certificando-se de deixar ambas as extremidades saindo das bordas do recipiente. Essa tira facilitará a extração do bloco de agarose.

Submerga o recipiente até a metade em um balde de gelo úmido. Em um béquer de vidro, aqueça 150 mililitros de PBS a 90 graus Celsius e adicione seis gramas de agarose, mexendo constantemente. Despeje lentamente a solução de 4% de agarose para criar uma camada de meio a um centímetro de espessura no fundo do recipiente e deixe solidificar.

Recubra completamente o cérebro com uma fina camada de óleo mineral para evitar que a agarose se ligue à superfície do cérebro ou fique presa no sulco. O óleo também torna a remoção do cérebro do gel de agarose muito mais fácil de administrar. Uma vez revestido, coloque o cérebro sobre a fina camada de agarose na orientação desejada para um mofo coronal ou sagital, o mais reto e ereto possível.

Deixe a solução de agarose esfriar até 50 graus Celsius enquanto mexe constantemente para manter uma viscosidade que pode ser despejada. Depois, despeje a solução de agarose sobre o cérebro até que ela esteja completamente embutida. Deixe a agarose solidificar em temperatura ambiente.

Corte a camada de agarose acima do cérebro com uma sonda cirúrgica seguindo o contorno cerebral. Quando o corte estiver completo ao redor do cérebro, use uma espátula fina para levantar suavemente a camada superior da agarose. Tome cuidado para não cortar ou cortar o cérebro durante essas etapas.

Remova suavemente todo o cérebro do molde. Deve sair relativamente fácil por causa do óleo mineral que foi aplicado na superfície anteriormente. Certifique-se de remover quaisquer pequenos pedaços de gel de agarose que possam ter caído na impressão.

Aqueça 98 mililitros de PBS em um béquer a 9 graus Celsius e adicione quatro gramas de agarose e dois mililitros de tinta da China. Mexa bem. Despeje essa solução de agarose negra na impressão feita pelo cérebro, tomando cuidado para não transbordar a impressão.

Deixe o gel preto solidificar. Segure as duas extremidades da tira plástica e levante todo o bloco de agarose do recipiente. Agora vamos ilustrar como criar placas modelo para sua matriz.

Para cortar o molde cerebral, coloque uma folha de papel em escala entre duas placas transparentes de acrílico de 76 milímetros e coloque-as próximas à borda da mesa. Depois, use grampos para fixar quatro quadrados de canto e duas placas de acrílico para construir duas paredes que segurem os blocos de agarose firmemente na orientação desejada. As bordas frontais dos dois quadrados metálicos dos cantos e das duas placas verticais de acrílico devem ser alinhadas ao longo de um dos lados do papel em escala.

Coloque o bloco de gel de agarose de modo que a borda a ser cortada se alinhe ao longo do papel de escamas e com as bordas das placas verticais de acrílico e dos quadrados de canto, e coloque um peso do lado oposto do bloco de agarose para mantê-lo na posição. Corte qualquer excesso do bloco até que o molde de tinta da Índia esteja prestes a ser cortado. Mova o bloco de agarose para frente nos passos desejados, por exemplo, dois milímetros ou cinco milímetros com a ajuda das marcações no papel de escala subjacente.

Segure a lâmina firmemente com as duas mãos e guie-a pelas bordas frontais das placas de acrílico e dos quadrados de canto para cortar o bloco. Coloque cada fatia em uma segunda folha de papel de escama e pressione firmemente para transferir a impressão no papel. Com uma caneta, faça o contorno de toda a fatia.

Remova a fatia e contorne o contorno cerebral identificado pela tinta da Índia. Note a orientação da primeira fatia no papel da escama, por exemplo, posterior e anterior para seções sagitales, e mantenha-a consistente quando fatias adicionais de gel forem adicionadas ao papel durante o processo. Numere cada traçado sequencialmente.

Corte as placas de acrílico em 10 por 8 1/2 centímetros. Depois, empilhe-as e fixe-as na etapa de uma furadeira de prensa usando quadrados de canto e grampos. Fure três furos na pilha com as coordenadas indicadas no manuscrito.

Remova a película protetora das placas de acrílico. Depois, coloque uma placa de acrílico acima de um molde no papel de escamas e alinhe o topo das linhas da placa acrílica com as bordas superiores do molho. Trace o contorno do cérebro na placa de acrílico com uma caneta permanente.

Rotule cada placa para corresponder ao número do modelo ou ao rastreamento cerebral. Usando a serra de fita, corte cada placa ao longo das linhas de molde copiadas. Alternativamente, uma ferramenta rotativa com ponta de entalhe em madeira pode ser usada para remover áreas indesejadas.

Polir a aresta de corte usando uma ferramenta rotativa com uma ponta de lixamento para alisar as bordas, pois bordas afiadas podem danificar o cérebro durante os cortes. Verifique novamente a precisão do corte colocando a placa de acrílico sobre o mole. Aparar e polir conforme necessário.

Em seguida, vamos ilustrar a montagem das placas. Pré-montar a matriz empilhando as placas em ordem sequencial e verifique o alinhamento das placas. A montagem da matriz começa com a colocação de três parafusos longos de aço inoxidável através da primeira placa acrílica e depois colocando uma arruela em cada parafuso.

Coloque a segunda placa e coloque arruelas em cada parafuso. Alternativamente, as arruelas podem ser coladas ao redor dos furos de ancoragem com supercola para evitar a necessidade de adicionar as arruelas individualmente em cada montagem. Repita esse processo até que todas as placas tenham sido adicionadas sequencialmente aos parafusos.

Aperte tudo junto com uma porca em cada parafuso. Realize um polimento final das bordas voltadas para o cérebro para facilitar a transição de placa para placa. Use marcadores de cores diferentes para colorir a borda superior das placas de acrílico com cores alternadas, facilitando muito o corte.

Aqui alternávamos placas pretas, vermelhas e sem marca. Por fim, vamos demonstrar o processo de corte do cérebro tanto no plano coronal quanto no sagital. Para cortar o cérebro, coloque-o na matriz na mesma orientação que estava durante o processo de moldagem e o mais reto possível.

Você vai precisar de uma lâmina larga e plana para cortar o cérebro. A lâmina larga limita o potencial de torção ou dobra durante o corte. Recomendamos uma lâmina criostatica de alto perfil.

Para segurança, enrole cerca de dois centímetros de uma das extremidades da lâmina com fita adesiva para criar um espaço para segurar com segurança a ponta enrolada durante o corte do cérebro. Uma nota de cautela aqui. Como cada parte do cérebro apresenta texturas diferentes após a fixação com formalina, deve-se ter cuidado para aplicar uma pressão uniforme na lâmina.

Além disso, o cérebro do leitão é grande, então é melhor usar um movimento de corte para cortar o cérebro do que um corte direto, empurrando para baixo. A lâmina deve ser puxada com força constante de um lado ao outro, certificando-se de ir fundo o suficiente para cortar todo o cérebro. Coloque todas as fatias em uma placa de seis poços preenchida com PBS ou bandeja de inox.

Coloque cuidadosamente as fatias na bandeja, mantendo a ordem e a orientação, e preserve ou proceda conforme necessário. Para ajustar a geometria ou expandir a cavidade e adaptá-la melhor ao cérebro, placas de acrílico selecionadas podem ser removidas ou adicionadas para adaptar a matriz a diferentes tamanhos de cérebro. Aqui ilustramos a expansão de uma matriz sagital construída para um cérebro de leitão P5 adicionando várias placas, aqui coloridas de azul e verde, à porção média da matriz.

A matriz agora é adequada para o corte sagital de um leitão-P38. A capacidade de expandir ou reduzir o tamanho da matriz aumenta muito a flexibilidade da matriz e pode economizar tanto materiais quanto esforço. Assim como no corte coronal, corte cuidadosamente o cérebro no plano sagital usando placas sucessivas para guiar a lâmina.

O sistema de codificação por cores ajuda a identificar a posição sequencial correta da lâmina, o que é difícil quando as fatias são finas. Retire o cérebro da matriz e separe delicadamente as fatias. Em conclusão, desenvolvemos um método fácil, econômico e flexível para criar matrizes cerebrais para leitões neonatais.

Esse conceito pode ser aplicado a porcos mais velhos e a outros modelos animais grandes.