Name: Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a otimizar o fluxo de trabalho IBEX usando bloqueio com heparina e detecção espectral para suprimir autofluorescência em tecidos humanos ricos em eosinófilos. Este método computacional permite análises proteômicas espaciais de alta plexidade com maior clareza.

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<table><tbody><tr><td>Solução de ácido sulfúrico 2N (H2SO4)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Béquer de 500 mL</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>BCL-6 - Alexa Fluor 647</td><td>BD em Biociências</td><td>561525</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Kit de Fixação/Permeabilização de Citofix/Citoperm BD</td><td>BD em Biociências</td><td>554722</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação de bancada</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Albumina Sérica Bovina (BSA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>CD11c - Alexa Fluor 700</td><td>BD em Biociências</td><td>561352</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD138/Syndecan-1 - PE</td><td>BioLegend</td><td>356503</td><td>Fator de diluição 1:200</td></tr><tr><td>CD20 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53020282</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD21 - Alexa Fluor 532</td><td>NovusBio</td><td>NBP2-60733AF532</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD23 - PE</td><td>BioLegend</td><td>338507</td><td>Fator de diluição 1:200</td></tr><tr><td>CD3 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>100320C0</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD31 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303134</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD34 - iFluor 594</td><td>AAT Bioquest</td><td>103400C0</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD38 - Alexa Fluor 700</td><td>BioLegend</td><td>303523</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD4 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>300520</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD45 - Alexa Fluor 532</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>58045942</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>353113</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Adesivo de Alúmen e Gelatina de Cromo</td><td>Oferta de Novos Chegados</td><td>1033A</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>NC9511236</td><td>Além disso, o Catálogo nº 50-465-347 para amostras maiores</td></tr><tr><td>Slide de calibração DAPI</td><td>Agar Scientific</td><td>AG2273</td><td></td></tr><tr><td>Solução DAPI, 1 mg/mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Fator de diluição 1:3000</td></tr><tr><td>E-cadherina/CD324 - Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>147307</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594</td><td>BioLegend</td><td>324228</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf/Falcon</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>FoxP3 - eFluor 660</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50577382</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Portas de microscópio de extremidade fosca</td><td>ChemScience</td><td>GEW45-2575-W</td><td></td></tr><tr><td>GL7 - Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>53590282</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Heparina sal sódico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>10KU</td></tr><tr><td>HLA-DR - PE</td><td>NovusBio</td><td>NB100-77855PE</td><td>Fator de diluição 1:200</td></tr><tr><td>Human TruStain FcX (Solução para Bloqueio de Receptores Fc)</td><td>BioLegend</td><td>422302</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Câmara de umidade</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Balde de gelo com tampa</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>IgD - Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>348215</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>IL4Ra/CD124 - PE</td><td>BioLegend</td><td>144803</td><td>Fator de diluição 1:200</td></tr><tr><td>Conversor de Arquivos Imaris</td><td>Instrumentos OXFORD</td><td>N/A</td><td>Cobrir qualquer formato de arquivo de imagem para o formato .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)</td></tr><tr><td>Isopentano (2-Metilbutano)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Ki-67 - Alexa Fluor 488</td><td>BD em Biociências</td><td>558616</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes Limpadores Delicados de Tarefa, 1-Camada</td><td>Ciência Kimtech</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Pinças grandes (ou seja, 25 cm de comprimento)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Borohidreto de lítio (LiBH4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>222356</td><td></td></tr><tr><td>MECA-79 - Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>53603680</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Tampa de lâmina de microscópio Vidro nº 1 22x50 mm</td><td>Fisher Scientific & nbsp;</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Água Milli-Q</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>MUC2 - Alexa Fluor 488</td><td>NovusBio</td><td>NB120-11197AF488</td><td>Fator de diluição 1:100</td></tr><tr><td>Cobertura Coberta Camerada Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>Caneta PAP</td><td>Abcam</td><td>AB2601</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>O que estiver disponível/usado no laboratório</td></tr><tr><td>Extensões SimpleITK Imaris</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Software usado para alinhar imagens de diferentes rodadas (https://github.com/niaid/imaris_extensions)</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Composto Tecido-Tecido O.C.T.</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980</td><td>Microscopia ZEISS</td><td>N/A</td><td>O sistema de imagem utilizado neste estudo</td></tr><tr><td>Zen Blue</td><td>Microscopia ZEISS</td><td>N/A</td><td>O software usado para processamento de imagens pós-aquisição</td></tr></tbody></table>

imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

High-plex Imaging using Spectral Confocal Microscopy to Minimize Non-specific Tissue Fluorescence

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

Highly multiplexed imaging enables the study of functionally diverse cells and their niches within their native tissue environments. Iterative Bleaching ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.

Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Demonstramos o uso da microscopia de localização por fotoativação por fluorescência (FPALM) para obter imagens simultâneas de vários tipos de moléculas marcadas com fluorescência dentro das células. As técnicas descritas produzem a localização de milhares a centenas de milhares de proteínas individuais marcadas com fluorescência, com uma precisão de dezenas de nanômetros dentro de células individuais.

Simultânea Multicolor Imagem de Estruturas Biológicas com fluorescência Fotoativação Localização Microscopia

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

Deposição de amiloide é uma marca registrada de diferentes doenças e aflige muitos órgãos diferentes. Este artigo descreve a aplicação da fluorescência luminescent oligothiophene conjugados coloração em combinação com técnicas de microscopia de fluorescência. Este método de coloração representa uma poderosa ferramenta para detecção e exploração de agregados de proteínas em configurações clínicas e científicas.

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Anticorpos que se ligam a receptores de alvo na superfície da pilha podem conferir alterações clusterização e conformação. Estas mudanças dinâmicas têm implicações para caracterizar o desenvolvimento de drogas em células-alvo. Este protocolo utiliza a microscopia confocal e espectroscopia de correlação de imagem através do ImageJ/FIJI para quantificar a extensão do receptor na superfície das células de clustering.

Microscopia confocal revela agregação de receptores de superfície celular através de espectroscopia de correlação de imagem

A imagem latente espectral transformou-se uma solução de confiança para a identificação e a separação de sinais múltiplos da fluorescência em uma única amostra e pode prontamente distinguir sinais do interesse do fundo ou do autofluorescence. A excitação-a imagem latente hiperespectrais da exploração melhora nesta técnica diminuindo o tempo necessário da aquisição da imagem ao simultaneamente aumentar a relação do sinal-à-ruído.

Microscopia de imagem hiperespectral de detecção de excitação para discriminar sinais de fluorescência de forma eficiente

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Aqui, é apresentado um protocolo para extração óptica e catalogação de assinaturas de fluorescência celular inata (ou seja, autofluorescência celular) de cada célula viva individual distribuída em um espaço tridimensional. Este método é adequado para estudar a assinatura de fluorescência inata de diversos sistemas biológicos em uma resolução unicelular, incluindo células de bactérias, fungos, leveduras, plantas e animais.

Reconstrução de assinaturas de fluorescência inata de células únicas por microscopia confocal

Aqui está descrito um método que pode ser usado para obter imagens de cinco ou mais parâmetros fluorescentes por microscopia imunofluorescente. Um pipeline de análise para extrair células únicas dessas imagens e conduzir análises de células únicas por meio de estratégias de gating semelhantes à citometria de fluxo é delineado, o que pode identificar subconjuntos de células em seções de tecido.

Gerando e analisando imagens histológicas de alto parâmetro com citometria de histofluxo

Este protocolo detalha as aplicações avançadas de imagem e o gerenciamento de recursos compartilhados de um sistema de microscópio confocal de varredura a laser integrado a um detector de matriz multiplexada para imagens celulares e subcelulares de alta resolução. O fluxo de trabalho permite imagens multimodais desde confocal até super-resolução (~120 nm) dentro de uma única plataforma, tornando a visualização em escala nanométrica mais acessível.

Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex

Aprenda a otimizar o fluxo de trabalho IBEX usando bloqueio com heparina e detecção espectral para suprimir autofluorescência em tecidos humanos ricos em eosinófilos. Este método computacional permite análises proteômicas espaciais de alta plexidade com maior clareza.

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

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