Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

Otimizamos um fluxo de trabalho IBEX que combina bloqueio de heparina e detecção espectral para suprimir o fundo em tecidos humanos ricos em eosinófilos. Autofluorescência e ligação de grânulos de eosinófilos obscurecem o sinal verdadeiro. Focamos em ambos para habilitar mapas limpos com alto Plex.

Para começar, desenhe um círculo no ferrolho de vidro ao redor do papel fixo usando uma caneta de papaou para criar uma barreira hidrofóbica. Adicione aproximadamente 100 microlitros de PBS a cada tecido para reidratá-los e incube a lâmina por cerca de dois minutos em temperatura ambiente para lavar o composto ideal para o corte. Aspire o PBS ao redor do tecido usando uma pipeta Pasteur de vidro de sucção.

Depois, adicione 100 microlitros de tampão bloqueador a cada tecido e incube em temperatura ambiente em uma câmara de umidade por uma hora. Agora aspire o buffer de bloqueio usando uma pipeta. Adicione 100 microlitros de coloração misturados a cada tecido e incube a lâmina em uma câmara de umidade coberta dentro de uma geladeira a quatro graus Celsius durante a noite.

Da mesma forma, prepare-se a cor em seção com apenas um fluoróforo e um controle negativo sem qualquer coloração para definir o espectro do fluoróforo e a autofluorescência tecidual. Após aspirar a mistura de tingimento, lave o tecido três vezes com PBS e aspire o líquido após cada lavagem. Coloque a amostra no microscópio para imagem.

Foque na amostra usando o modo de contraste de campo claro ou interferência diferencial. Depois, mude para o modo fluorescência e configure os parâmetros de aquisição espectral de acordo com os requisitos experimentais. Atribua os lasers apropriados para os fluoróforos usados no experimento.

Selecione um divisor de feixe que corresponda às linhas de laser escolhidas. Permitir que todos os detectores capturem todo o espectro de emissão e ajustar a resolução de aquisição da imagem para uma das resoluções predefinidas. Ou escolha a resolução máxima.

Ajuste o tamanho do orifício para uma unidade de área para uma seção óptica ideal. Otimize as configurações do laser antes da aquisição. Usando uma seção tingida com todos os marcadores, inicie o modo de varredura contínua com baixa potência do laser.

Ajuste o ganho mestre de cada detector, bem como as intensidades do laser, até que todos os marcadores sejam identificáveis com uma boa relação sinal-fundo. Ajuste finamente as intensidades do laser e alterne iterativamente entre seções de coloração única e seções multi-coloração até que todos os sinais de fluoróforo sejam visíveis sem supersaturação. Ative o recurso de blocos no software de aquisição e defina a região de aquisição dos blocos ao redor do tecido para garantir cobertura total da imagem.

Otimize o foco para a região de aquisição do azulejo no centro do tecido. Identifique uma característica estrutural única, como um conjunto distinto de células em uma disposição reconhecível, para servir como referência para alinhamento em rodadas de imagem posteriores. Agora ative o recurso Z-stack e navegue até a aba Z-stack.

Na aba central, defina o número de fatias para pelo menos seis com um intervalo de no mínimo um micrômetro entre as fatias. Clique no botão central para definir o ponto de foco atual determinado na etapa anterior como a fatia do meio da pilha. Clique no botão iniciar experimento para iniciar a aquisição da imagem.

Após a aquisição estar concluída, clique com o botão direito na miniatura da imagem, selecione Salvar Como. Escolha a localização do arquivo e nome da imagem. Faça backup dos dados da imagem para armazenamento seguro. Desmixe a imagem usando as mesmas configurações otimizadas aplicadas durante a aquisição da região tiled.

Capture um snap de cada controle com uma única coragem para obter o verdadeiro espectro de sinal e do controle não corado, para capturar fundo ou autofluorescência. Use essas imagens exclusivamente para desmistura espectral. Confirme que a região selecionada representa um sinal verdadeiro, verificando que a intensidade e a morfologia estão ausentes ou equivalentes aos níveis de fundo no controle não colorido e que a localização dos marcadores corresponde ao padrão celular esperado, como distribuição de membrana, nuclear, citoplasmática ou secretada.

Abra a imagem de snap no software. Clique na aba de desmistura e selecione uma das ferramentas de seleção de região na aba de ferramentas não misturadas, desenhe uma região de interesse ou ROI ao redor do sinal positivo para gerar o espectro dessa região. Compare cada espectro gerado com o espectro teórico de emissões do fluoróforo correspondente.

Certifique-se de que a região represente com precisão o sinal verdadeiro. Nomeie cada espectro de acordo com a identidade do fluoróforo e salve no banco de dados espectral. Em seguida, carregue a imagem em tilos e abra a ferramenta de desmistura.

Use o botão mais para adicionar os espectros de referência de cada fluoróforo à lista de desmistura. Clique no botão de desmistura linear para separar os sinais espectrais e salvar a imagem não misturada. Prepare a solução de branqueamento em uma exaustão de fumo.

Usando uma microespátula, pese 10 miligramas de borohidreto de lítio diretamente em um béquer seco. Adicione cuidadosamente 10 mililitros de água ultrapura no béquer e misture até que o composto esteja totalmente dissolvido. Adicione aproximadamente 100 microlitros da solução de branqueamento recém-preparada a cada seção de tecido usando uma pipeta Pasteur de vidro e incube as lâminas em temperatura ambiente por 15 minutos dentro da exaustão.

Se o clareamento violeta brilhante morrer, transfira cuidadosamente a lâmina para um microscópio epifluorescente e selecione o filtro de papo. Foque a amostra e ilumine em potência máxima. Agora use uma objetiva 5X para alcançar um campo de iluminação maior e abaixe completamente o palco para evitar qualquer contato entre o ferrolho e a objetiva ou carcaça.

Por fim, decante a solução de borohidreto de lítio de cada poço usando uma pipeta de vidro Pasteur e retorne ao béquer original de solução branqueante. Lave as lâminas três vezes com tampão de diluição e incube por aproximadamente três minutos em cada lavagem. Adicione a mistura de anticorpos e colore a amostra como demonstrado anteriormente.

Em tecidos polipos nasais não tratados, a coloração com CD3, CD4 e CD20 mostrou intensa fluorescência granular inespecífica em regiões ricas em eosinófilos. Enquanto o sinal verdadeiro localizado na membrana estava presente em menor intensidade. O pré-tratamento com leite desnatado 5% não bloqueou completamente a fluorescência inespecífica e também reduziu a intensidade do sinal para fluoróforos como AF 532.

O pré-tratamento com dab reduziu a fluorescência inespecífica dos CD20, CD3 e CD4, mas também diminuiu a intensidade real do sinal em múltiplos canais, incluindo DAPI e AF 532. O pré-tratamento com heparina bloqueou efetivamente a ligação inespecífica, mantendo alta intensidade de sinal para CD3, CD4, CD20 e DAPI. A heparina bloqueou sinais inespecíficos de forma dependente da concentração, com supressão completa alcançada em 10 unidades e sem efeitos prejudiciais observados em concentrações mais altas.

Um sistema de imagem de três faixas reduziu o tempo de aquisição, mas introduziu diafonia, incluindo o bleed through do AF 594 para o canal PE, e a autofluorescência tecidular aprimorada devido a múltiplas excitações a laser. A imagem espectral eliminou quase todo o fundo e diafonia, além de reduzir o tempo de aquisição e melhorar a relação sinal-fundo. Imagens espectrais IBEX de um pólipo nasal humano revelaram estruturas epiteliais marcadas por EpCAM.

células imunes como linfócitos CD3 positivos e CD20, e vasos que expressam CD31 e CD34. O tratamento com heparina eliminou a ligação dos grânulos sem reduzir o sinal, mantendo forte supressão de fundo ao longo dos ciclos IBEX. A desmistura espectral reduz o bleed through, e a autofluorescência aumenta o sinal para o fundo e acelera significativamente a aquisição multi-painel em comparação com a confocal multi-trilha.

Isso permite proteômica espacial robusta e tecidos desafiadores, apoiando mapeamento preciso do estado celular e análise em nível de vizinhança.