Induzindo hipertermia leve direcionada em modelos de tumores murinos por meio da conversão fototérmica de luz infravermelha próxima por nanobastões de ouro intratumorais

A terapia hipertérmica direcionada é uma modalidade emergente no tratamento do câncer projetada para elevar seletivamente as temperaturas do tumor, minimizando os danos ao tecido saudável circundante. Este método descreve uma maneira altamente eficiente, de baixo uso intensivo de recursos e reprodutível de induzir hipertermia mediada por nanobastões de ouro em tumores sólidos. O emprego de injeção intratumoral direta de nanobastões de ouro seguida de exposição à luz infravermelha próxima permite o aquecimento preciso, controlado e altamente localizado dos tumores.

O sucesso deste protocolo depende da ativação eficiente do tecido profundo de nanobastões de ouro usando o comprimento de onda apropriado da luz infravermelha próxima, bem como do monitoramento preciso em tempo real da temperatura interna do tumor durante todo o procedimento. Comece as medições diárias do tumor a partir do sétimo dia, após a injeção de células cancerígenas ou sempre que os tumores se tornarem palpáveis. Antes de iniciar o procedimento, meça a largura, o comprimento e a altura do tumor para calcular o volume total do tumor.

Procure realizar o procedimento assim que os tumores atingirem um volume aproximado de 50 milímetros cúbicos. Para o nosso modelo, esse volume tumoral foi alcançado entre o dia 10 e o 12 após a injeção de células cancerígenas. Em um gabinete de segurança biológica estéril, use uma seringa de um mil com uma agulha de calibre 31 para extrair o volume apropriado de nanobastões de ouro com base em cada volume de tumor.

Antes da injeção de nanobastões de ouro, anestesiar o mouse usando um cone nasal que fornece 2% de isoflurano a uma taxa de fluxo de 0,8 litros por minuto. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento e minimizar qualquer dano potencial ao laser. Se necessário, raspe o excesso de pelos ao redor do tumor para garantir a exposição da superfície da pele e use etanol para desinfetar a superfície do tumor, limpando qualquer pelo ou detritos.

Antes da exposição ao laser, injete nanobastões de ouro intratumoralmente a uma concentração de um micrograma por milímetro cúbico de volume tumoral. Se necessário, divida a injeção entre dois locais intratumorais para garantir a distribuição eficiente de nanobastões dourados dentro do tumor. Certifique-se de limpar qualquer excesso de nanobastões dourados na superfície da pele após a injeção.

Para camundongos do grupo controle, administre uma injeção intratumoral de PBS estéril do volume equivalente usado para os grupos de tratamento com nanobastões dourados. Limpe a sonda de temperatura intratumoral com etanol antes da inserção. Insira suavemente a sonda de temperatura no meio da massa tumoral.

Aplique uma camada uniforme de gel de aloe vera com aproximadamente cinco milímetros de espessura sobre a superfície do tumor para evitar ulceração da pele e minimizar o risco de lesão térmica durante o tratamento. Ajuste o laser para alinhar diretamente acima do meio do tumor. Use a tabela de pesquisa de irradiância para determinar a melhor altura do laser com base no diâmetro do feixe de laser necessário para cobrir a área da superfície do tumor.

Ligue o laser e a fonte de resfriamento termoelétrica. Em seguida, conecte o sistema de laser à fonte de alimentação. Ligue a fonte de resfriamento termoelétrico.

A luz LED azul acenderá e após 30 segundos, a temperatura se estabilizará em 25 graus Celsius. Com base na tabela de pesquisa de irradiância, ajuste a saída de corrente do laser para obter uma irradiância alvo de aproximadamente um watt por centímetro quadrado. Em nosso experimento, uma altura de laser de 1,5 centímetros, um diâmetro de feixe de 1,3 centímetros e uma corrente de laser de 1800 miliamperes resultaram em um valor de irradiância de 0,82 watts por centímetro quadrado, que foi otimizado para nosso modelo de tumor.

A partir deste ponto, certifique-se de que todos os indivíduos na sala de operação do laser usem óculos de segurança a laser certificados para o comprimento de onda da luz usada. Configure uma câmera térmica adjacente à plataforma de laser direcionada ao mouse para monitorar a temperatura da superfície da pele durante o procedimento a laser. Comece a gravar no software de registro de dados termoacoplado e certifique-se de que o gráfico de temperatura versus tempo interno do tumor esteja sendo exibido em tempo real.

Gire a chave de segurança do laser para ativar a saída da fonte. Inicie a administração do laser pressionando o pedal para baixo No momento do início do laser, a temperatura interna do tumor começará a aumentar, levando aproximadamente 15 segundos a dois minutos para entrar na faixa hipertérmica alvo de 42 a 48 graus. Se a temperatura interna do tumor se aproximar de 48 graus, tire o pé do pedal, permitindo que a temperatura caia novamente.

Essa queda na temperatura deve se tornar visível em tempo real no gráfico de exibição de temperatura versus tempo. Quando a temperatura interna do tumor cair para cerca de 43 graus, reative a administração do laser usando o pedal. A temperatura deve começar a subir novamente sem sair da faixa hipertérmica.

Continue ligando e desligando o laser para garantir que o tumor permaneça na faixa hipertérmica. O gráfico de exibição de temperatura versus tempo deve começar a refletir isso no padrão de ciclo desligado do laser. Durante a manutenção da hipertermia tumoral, monitore continuamente a temperatura da superfície da pele para garantir que ela permaneça abaixo de 50 graus Celsius.

Após cinco minutos de manutenção da hipertermia, solte o pedal para interromper a administração do laser e permitir que a temperatura interna do tumor caia para cerca de 37 graus Celsius. Assim que o tumor retornar à temperatura normal, remova a sonda de monitoramento de temperatura e limpe qualquer excesso de gel de aloe vera na superfície do tumor. Remova o mouse do anestésico do cone do nariz e monitore a excitação do animal antes de retornar à gaiola Para recuperação após o procedimento, coloque a gaiola parcialmente em uma almofada térmica, conforme mostrado aqui.

Certifique-se de que os ratos voltaram ao comportamento normal antes de devolvê-los às suas instalações de alojamento. Esta tabela fornece valores de irradiância em watts por centímetro quadrado para diferentes configurações de saída de corrente do laser em miliamperes e distâncias de trabalho em centímetros. Esta tabela é usada para determinar a altura apropriada do laser com base no diâmetro do feixe necessário para cobrir a superfície do tumor e atingir uma irradiância alvo de aproximadamente um watt por centímetro quadrado.

Os valores destacados em verde nesta tabela indicam níveis ideais de irradiância próximos a um watt por centímetro quadrado. Esta figura mostra perfis representativos de temperatura interna do tumor ao longo do tempo em milissegundos registrados pela sonda de temperatura interna do tumor durante a exposição do tumor à luz infravermelha próxima. A Figura A mostra o padrão de ciclagem de laser em um camundongo injetado com nanobastões de ouro necessário para manter a temperatura interna do tumor na faixa hipertérmica.

Ele destaca a importância do monitoramento rigoroso da temperatura interna do tumor e do ciclo de administração do laser para manter a amplitude hipertérmica durante todo o procedimento. A Figura B mostra a diferença média na temperatura interna do tumor entre o nanarod de ouro injetado e o controle, ou camundongos injetados com PBS durante os cinco minutos de exposição à luz infravermelha próxima. Sem a injeção de nanobastões de ouro, os tumores expostos à luz infravermelha próxima não aquecerão na faixa hipertérmica leve.

Os tumores injetados PBS se estabilizam em torno de 39 a 40 graus Celsius, em contraste com os tumores injetados com nanobastões de ouro que atingem temperaturas hipertérmicas de 42 a 48 graus. Nossa terapia hipertérmica direcionada mediada por nanobastões de ouro induz o encolhimento do volume do tumor em vários modelos de câncer de espelhamento dentro de 48 a 72 horas após o tratamento. A Figura A mostra as medições do volume do tumor em 4T1, um modelo de câncer de mama após terapia hipertérmica direcionada mediada por nanobastões de ouro.

A Figura B mostra B16 F10, um modelo de melanoma, e a figura C mostra CT26, um modelo de câncer colorretal. Uma redução ou desaceleração do crescimento do volume tumoral dentro de 48 a 72 horas após o tratamento é indicativa de um resultado positivo. Ao realizar este protocolo, o monitoramento preciso em tempo real da temperatura interna do tumor é crucial para garantir que a faixa hipertérmica leve seja alcançada e que o tratamento esteja sendo administrado de forma consistente.

Após este procedimento, medições diárias do volume do tumor devem ser realizadas para registrar alterações no volume do tumor. A regressão do tumor dentro de dois a três dias é um indicador positivo do sucesso do tratamento.