Um sistema de perfusão normotérmica de código aberto projetado para cientistas pesquisadores

O microambiente tumoral humano é um complexo vivo e em evolução que responde a perturbações de drogas de maneiras difíceis de prever em nível celular. Nosso objetivo tem sido sustentar o microambiente do tumor humano ex vivo sob condições fisiológicas próximas para interrogatórios detalhados. A máquina apresentada aqui aborda a falta de sistemas de profusão normotérmica acessíveis para aplicações de pesquisa, permitindo estudos iterativos para um grande número de desfechos experimentais desejados.

Nosso laboratório continuará trabalhando para reduzir ainda mais a máquina para profusão completamente autóloga, permitindo o sistema para investigações de imuno-oncologia e terapia celular. Para começar, coloque o funil do tambor no lado direito da estação de trabalho com o bico estendendo-se além da borda frontal da mesa. Coloque uma espuma viscoelástica circular para encaixar na base do tambor com o diafragma posicionado embaixo da espuma.

Deixe um espaço de dez centímetros perto do bico para saída. Em seguida, coloque duas mantas de aquecimento de água em cima da inserção de espuma com a tubulação do conector voltada para o canto superior esquerdo e insira uma farpa Luer macho de 3/16 de polegada em cada tubo. Pegue uma cortina dobrada, estéril e mais quente.

Corte dois milímetros do canto da dobra para criar um orifício de saída e coloque-o no tambor. Em seguida, obtenha o conector de saída impresso em 3D e insira o ímã em sua ranhura. Coloque este conjunto abaixo da cortina através do bico de saída e alinhe o orifício cortado com o orifício no conector e no ímã.

Levante o excesso de cortina para cobrir o funil do tambor e prenda-o com elásticos ou elásticos. Dobre o excesso de cortina por cima para estabelecer uma barreira estéril. Agora coloque a segunda camisa de água em cima da cortina totalmente dobrada.

Em seguida, pegue um pedaço de tubo de 30 polegadas de 1/4 de polegada e conecte a extremidade proximal à saída na base do bico do funil do tambor e descanse próximo ao suporte do reservatório, que será conectado posteriormente. Agora, coloque as bombas em um carrinho móvel posicionado próximo ao lado esquerdo da estação de trabalho. Posicione o suporte em dois grampos diretamente atrás das bombas, de modo que os grampos sejam elevados seis polegadas acima das bombas.

Além disso, obtenha dois cabeçotes de bomba e prenda cada um em uma das bombas. Coloque dois oxigenadores nos clamps no suporte em uma orientação horizontal. Em seguida, conecte a tubulação de entrada de gás arterial e venosa de 1/8 de polegada ao conector inferior superior direito de seu respectivo oxigenador.

Agora, remova todos os tubos do kit de hemodiálise, exceto as linhas que levam diretamente ao filtro. Coloque uma bomba de rolo grande imediatamente à direita do filtro de hemodiálise para entrada de sangue. Em seguida, coloque duas bombas peristálticas menores à direita da bomba do rolo de sangue para entrada e saída de dialisato.

Obtenha dois tubos peristálticos de 1/8 de polegada e insira-os na bomba branca clamp. Prenda uma farpa Luer fêmea de 1/8 de polegada em ambas as extremidades de cada tubo. Para conectar a bolsa de dialisato à entrada do filtro, conecte a tubulação de 1/8 de polegada ao conector Luer na bolsa.

Conecte um Luer macho de 1/8 de polegada à extremidade da tubulação e conecte-o à tubulação da bomba peristáltica de entrada. Conecte os circuitos de entrada e saída às portas de filtro de hemodiálise apropriadas. Coloque o reservatório dentro do suporte do reservatório com as marcações de medição externas e o conector com tampa amarela voltado para fora.

Em seguida, corte um pedaço de tubo de 36 polegadas de 5/16 polegadas. Conecte um conector Y à extremidade distal desta tubulação e conecte a extremidade proximal à torneira de saída na parte inferior do reservatório. Corte dois pedaços de tubo de 4 polegadas de 5/16 polegadas e prenda cada um na extremidade do conector Y.

Conecte as outras extremidades desses tubos aos pinos horizontais dos cabeçotes da bomba. Em seguida, corte dois pedaços de tubo de 4 polegadas de 1/4 de polegada e conecte um a cada farpa vertical nas cabeças da bomba. Prenda a outra extremidade ao pino inferior esquerdo de cada oxigenador.

Agora pegue um segmento de 30 polegadas de tubo de 5/16 polegadas. Corte a tubulação ao meio e coloque um conector Y de 5/16 polegadas sobre a extremidade do corte distal. Conecte a extremidade proximal à farpa de saída do oxigenador venoso.

Reconecte a outra metade à farpa superior do conector Y. Para o lado sampcircuito de amostragem, corte um pedaço de tubo de 2 polegadas de 1/4 de polegada. E usando uma chave de agulha, estique a extremidade proximal.

Conecte este tubo elástico à farpa restante do conector Y de 5/16 polegadas. Depois de conectar o sensor de derivação da cubeta, conecte a parte horizontal de um conector T fêmea a uma tubulação de 1/8 de polegada equipada com um Luer macho. Anexe uma clave de amostragem ao aspecto perpendicular do conector T.

Por fim, conecte uma Luer macho de 1/8 de polegada ao outro lado horizontal do conector T. Em seguida, corte um comprimento de 12 polegadas de tubo de 1/8 de polegada e conecte a extremidade proximal à clave de amostragem. Conecte um Luer macho de 1/8 de polegada à extremidade distal e conecte-o a um segundo conector T fêmea.

Em um lado deste conector T, conecte um Luer macho de 1/4 de polegada e use um pedaço de tubo de 1/4 de polegada de duas polegadas para conectá-lo a uma farpa de entrada do reservatório. Na extremidade distal da tubulação de 5/16 polegadas, conecte outro conector Y de 5/16 polegadas. Obtenha aproximadamente 55 polegadas de tubo de 1/4 de polegada e conecte-o à farpa superior do conector Y.

Para o circuito sanguíneo de hemodiálise, conecte um Luer macho de 1/4 de polegada à extremidade distal do tubo de 1/4 de polegada. Passe este tubo pela bomba de rolo grande e conecte-o à porta de entrada de sangue na parte superior do filtro de hemodiálise identificado pelo tubo revestido de vermelho. Em seguida, pegue um pedaço de tubo de 24 polegadas de 1/4 de polegada e prenda um Luer macho na extremidade proximal.

Conecte este tubo à porta de saída de sangue revestida de azul do filtro de hemodiálise. Em seguida, prenda a extremidade distal à farpa de entrada do reservatório. Pegue um pedaço de tubo de 36 polegadas de 1/4 de polegada e estique-o para encaixar firmemente na farpa do conector Y de 5/16 polegadas.

Em seguida, obtenha três torneiras de quatro vias e conecte-as em uma sequência linear. Conecte este conjunto à porta perpendicular de um conector T fêmea. Insira este componente a 12 polegadas do lado esquerdo do tubo de 1/4 de polegada.

Em seguida, conecte sensores de fluxo externos ao tubo de 1/4 de polegada imediatamente a jusante do local de infusão do medicamento. Faça um corte de cinco centímetros distal aos sensores de fluxo e insira sensores de pressão com extremidades farpadas no tubo de 1/4 de polegada. Coloque a parte distal da tubulação no centro do funil do tambor.

Em seguida, corte um tubo de 30 polegadas de comprimento de 5/16 polegadas e conecte sua extremidade proximal à farpa de saída direita do oxigenador arterial. Corte este tubo no ponto médio e insira um conector Y de 5/16 polegadas. Em seguida, corte um segmento de 36 polegadas de tubo de 1/4 de polegada e conecte-o à farpa do conector Y de 5/16 polegadas.

Reconecte o sensor de fluxo externo. Faça um corte de cinco centímetros a jusante e conecte os sensores de pressão à extremidade da tubulação posicionada no centro do funil do tambor para o fluxo arterial. Em seguida, corte um pedaço de tubo de 30 polegadas de 1/4 de polegada e prenda um Luer macho de 1/4 de polegada na extremidade proximal para eventual conexão com o fluxo de saída da veia cava inferior da amostra.

Corte este tubo a 6 polegadas do reservatório e conecte Luer macho de 1/4 de polegada em ambas as extremidades. Insira um conector T fêmea com uma clave de amostragem na porta perpendicular. Introduzir perfusato no circuito seguindo o método descrito anteriormente.

Reaqueça e conecte a amostra e comece a perfusão. Nas primeiras 24 horas de perfusão hepática suína, os fluxos da artéria hepática e da veia porta foram em média de 107 e 501 mililitros por minuto, respectivamente, com pressões de entrada estáveis de 80 e 7,1 milímetros de mercúrio. As saturações de oxigênio arterial, portal e venosa em fígados suínos foram em média de 95%85% e 74%, com pH permanecendo próximo a 7,2.

Os níveis de glicose diminuíram de forma constante. O hematócrito e a hemoglobina permaneceram estáveis e o potássio caiu ligeiramente. Os fígados suínos produziram 41 mililitros de bile e apresentaram elevação moderada do lactato na perfusão humana.

Os fluxos arteriais e venosos foram em média de 113 e 317 mililitros por minuto e a saturação de oxigênio atingiu 98%92% e 86% nas veias arteriais, porta e hepática. Os fígados humanos mantiveram pH fisiológico, hematócrito e hemoglobina estáveis, e mostraram declínio da glicose e aumento do lactato com produção de bile em média de 1,4 mililitros por hora. A histologia confirmou parênquima hepático viável e morfologia tumoral após a perfusão.

Uma configuração móvel permitiu a imagem de TC de fígados perfundidos, produzindo qualidade radiográfica comparável às varreduras in vivo. O sistema também suportou a perfusão renal e pâncreas com glomerular preservado e ilhotas de Langerhans.