Avanços no perfil metabólico de esferoides tridimensionais de tumores cerebrais para triagem de drogas

A pesquisa visa otimizar a formação de raízes celulares 3D para estudar o metabolismo energético usando a tecnologia Seahorse, com foco na atividade metabólica comportamental celular e nas respostas a medicamentos em nosso modelo clinicamente relevante. Essas descobertas aprimorarão os modelos de fundição de medicamentos, fornecendo uma representação mais precisa dos tumores cerebrais, melhorando a avaliação da terapia e a análise metabólica para melhores estratégias de tratamento. Os resultados abriram caminho para investigar como o metabolismo energético se altera em modelos esferóides 3D, como os efeitos de saída das drogas nas vias metabólicas e os mecanismos pelos quais as alterações metabólicas contribuem para o desenvolvimento da resistência do tumor à terapia.

Depois de ressuspender as células U87 coletadas no DMEM, pré-aqueça o meio não utilizado a 37 graus Celsius. Mantenha as suspensões celulares em temperatura ambiente por 30 minutos. Com base na contagem inicial de células, diluir a suspensão celular com DMEM contendo 10% de FBS até um volume final de 20 mililitros, garantindo aproximadamente 200.000 células.

Misture bem a suspensão celular final por inversão repetida. Adicione lentamente 200 microlitros da suspensão ao longo da borda de cada poço em uma placa de 96 poços de fixação ultrabaixa de fundo redondo transparente e, em seguida, sele a placa firmemente com Parafilm para evitar vazamentos durante a centrifugação. Coloque a placa selada na centrífuga e deixe funcionar a 200 G por dois minutos para granular as células no fundo de cada poço.

Remova a placa da centrífuga. Remova cuidadosamente o Parafilm e coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Para preparar uma solução de revestimento, dissolva cinco miligramas de Poli-D-lisina em 50 mililitros de água estéril e misture bem a solução, até dissolver completamente.

Adicione 30 microlitros da solução de revestimento a cada poço da placa de ensaio metabólico. Garanta a ausência de bolhas agitando suavemente a placa ou aspirando o excesso de solução. Incube a placa com a tampa por 20 minutos em temperatura ambiente, aspire a solução de revestimento e lave os poços duas vezes com 200 microlitros de água estéril.

Seque a placa ao ar por pelo menos 30 minutos e, em seguida, aqueça a placa a 37 graus Celsius sem dióxido de carbono por 30 minutos para estabilizar o revestimento. Depois, adicione 175 microlitros de meio pré-aquecido a cada poço. Mantenha a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora livre de dióxido de carbono, até que esteja pronta para a transferência de esferóides celulares.

Transfira as placas esferoides para um sistema de imagem de alto conteúdo após cinco dias de cultura. Para configurar os parâmetros de imagem, defina a temperatura para 37 graus Celsius e o nível de dióxido de carbono para 5%Ajuste o tipo de placa, os canais e a faixa de foco nas configurações do sistema. Em seguida, adquira imagens de esferóides usando um microscópio confocal com objetivas de 10 vezes e o software de imagem, identifique os poços contendo esferoides intactos e registre suas posições para transferência.

Atribua os esferóides intactos a dois grupos, um grupo de controle com seis poços replicados e um grupo de tratamento com seis poços replicados para tratamento com fenofibrato. Preparar a solução de trabalho fenofibrato em meio fresco pré-aquecido na concentração óptima. Remova cuidadosamente o esferóide contendo a placa de baixa fixação do sistema de imagem e coloque-o em uma superfície estéril dentro de um gabinete de biossegurança.

Posicione a placa de ensaio revestida com poli-D-lisina adjacente a ela para transferência e, em seguida, apare a ponta de uma pipeta de 20 microlitros para permitir a aspiração suave dos esferóides celulares sem causar danos. Usando a ponta da pipeta aparada, aspire suavemente cada esferóide intacto do fundo de seu poço. Transferir cada esferóide para o poço correspondente da placa revestida e deixá-lo repousar durante 20 segundos.

Transfira as placas de ensaio esferoides 3D para um sistema de imagem de alto conteúdo. Para analisar os dados morfológicos, aplique o módulo de região de textura para separar grosseiramente os esferoides 3D do plano de fundo, dividindo o conteúdo da imagem em três clusters com base nos recursos de textura. Aplique o módulo localizar região de imagem para refinar a separação de esferoides 3D pré-isolados usando características de tamanho baseadas em volume, garantindo que as impurezas sejam removidas e os esferoides intactos sejam retidos.

Meça os parâmetros morfológicos dos esferóides 3D usando o módulo de propriedades morfológicas. Aplique o módulo de população selecionada para filtrar e reter apenas esferoides de células 3D genuínas e, em seguida, exporte os resultados dos dados morfológicos. Os esferoides foram visivelmente formados no quinto dia de cultivo, mantendo uma morfologia esférica uniforme em todas as amostras observadas.

Um esferóide desintegrado com integridade estrutural visivelmente interrompida também foi observado no quinto dia. A análise pós-transferência revelou que os esferoides 3D tratados com controle e fenofibrato permaneceram intactos na maioria dos casos, mas alguns esferoides tratados com fenofibrato foram desintegrados. A taxa de consumo de oxigênio foi significativamente reduzida em esferoides tratados com fenofibrato em todos os pontos de tempo em comparação com o grupo controle.