Modelagem de doenças mitocondriais usando organoides cerebrais: um foco na encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a derrames
10 de outubro de 2025
Os organoides cerebrais servem como um modelo valioso para estudos de encefalomiopatia mitocondrial, acidose láctica e episódios semelhantes a AVC (MELAS), oferecendo insights sobre sua fisiopatologia subjacente e fornecendo uma plataforma para triagem de drogas. Organoides derivados de linhagens celulares com níveis variados de heteroplasmia de genes causadores de doenças exibem diferenças fenotípicas significativas.
O escopo da nossa pesquisa é entender medidores de doenças mitocondriais e encontrar medicamentos para tratá-las. O desafio é manter a capacidade para ensaios de alta produtividade, mesmo que a técnica contenha formação de organoides. Para começar, remova o meio das placas de cultura pluripotente induzida de células-tronco quando elas estiverem aproximadamente entre 70 e 80% de confluente.
Lave as células com PBS. Adicione 350 microlitros de solução enzimática às células e incube. Adicione 800 microlitros de meio de ajuste para haste para parar a reação.
Após transferir a suspensão da célula para um tubo novo, centrifuge-a a 190G por cinco minutos a 22 graus Celsius. Em seguida, re-suspenda o pellet em um mililitro de meio diferenciador. Após contar as células, semeie 3000 células em 100 microlitros em cada poço de uma placa de fixação baixa em formato de U de 96 poços.
Incube por seis dias a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, use uma pipeta de grande diâmetro para transferir os organoides da placa de 96 poços para uma placa de 10 centímetros. Pipete 50 microlitros de meio suplementado DMEM/F12 para cada poço de uma nova placa de 96 poços.
Colete os organoides em tubos de dois mililitros. Remova o meio com cuidado sem aspirar os organoides e adicione 1,5 mililitro de meio suplementado DMEM/F12. Depois de pipetar a última lavagem, adicione 500 microlitros de meio fresco.
Depois, transfira os organoides para um prato de 10 centímetros. Adicione cinco mililitros de meio para facilitar a escolha de cada organoide. Transfira todos os organoides para cada poço de uma placa de 96 poços usando uma micropipeta ajustada a 50 microlitros e incube por três dias.
No nono dia, colete os organoides em tubos de dois mililitros e lave três vezes com DMEM/F12. Depois, resuspenda os organoides em meio diferenciador. Transfira aproximadamente 10 organoides por poço para uma placa de seis poços e ajuste o volume final de meio em cada poço para dois mililitros.
Cultive a placa estaticamente por seis dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No 15º dia, colete os organoides em tubos de 15 mililitros. Depois de deixar os tubos se estabilizarem, adicione um novo meio de diferenciação suplementado com B27 e vitamina A após pipetar o sobrenadante.
Transfira aproximadamente 10 organoides por poço para uma placa de seis poços. Cultive o organoide estaticamente por 15 dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Recubra as placas de cultura com a solução diluída de poli-L-Ornitina.
Incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, lave os poços três vezes por cinco minutos cada com PBS. Agora adicione solução de laminina diluída aos poços.
Incube as placas por três horas a 37 graus Celsius, ou durante a noite. Centrifuge a suspensão organoide a 200G por cinco minutos. Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de solução enzimática.
Misture bem e incube a 37 graus Celsius por cinco minutos antes de centrifugar. Após remover o sobrenadante e adicionar um mililitro de solução de dispersão, cuidadosamente faça camadas na solução isolante sob a suspensão. Depois, centrifuge a suspensão a 200G por cinco minutos.
Agora, pipete um mililitro de meio neuronal no tubo. Misture a solução e passe a suspensão por um filtro de 70 micrômetros para um tubo de 50 mililitros. Após contar as células, semeie a suspensão celular a uma densidade de 100.000 células por centímetro quadrado em placas revestidas de poli-L-Ornitina e Laminina.
Troque o médio a cada quatro a sete dias até o dia 60. Para fixar os organoides para imunofluorescência, primeiro colhe-os em microtubos. Enxague os organoides com PBS e depois fixe os organoides em 4% de paraformaldeído por 30 minutos em temperatura ambiente.
Após a fixação, lave os organoides fixos três vezes com PBS. Armazene os organoides a quatro graus Celsius até serem usados. 30 dias após a semeadura para a cultura neuronal 2D, remova o meio de cultura das placas.
Depois, lave as células com PBS. Fixe as células com 4% de paraformaldeído por 15 minutos em temperatura ambiente. Pipete o paraformaldeído e lave as células com PBS três vezes.
Armazene as células fixas a quatro graus Celsius até serem usadas. Para coletar os organoides para o RTQPCR, transfira-os para microtubos. Pipete PBS nos tubos para lavar os organoides.
Agora, adicione 350 microlitros de tampão de lise aos organoides e depois congele rapidamente em nitrogênio líquido. Guarde os tubos a menos 80 graus Celsius até serem usados. Organoides cerebrais contendo neurônios positivos para FOXG1 foram induzidos com sucesso a partir da linha IPSC controle saudável 414C2 no dia 30, e redes neurais cultivadas em 2D foram obtidas no dia 60.
Os níveis de heteroplasma da variante M.3243A a G foram confirmados pelo QPCR. As linhas dois a oito apresentaram baixa heteroplasmia, e as linhas dois a seis apresentaram alta heteroplasmia. Organoides cerebrais derivados da linha de baixa heteroplasmia dois a oito apresentaram tamanhos e morfologias semelhantes aos dos controles saudáveis.
Organoides gerados a partir da alta linha de heteroplasma dois a seis apresentaram tamanho reduzido de 0,3 milímetros quadrados e morfologia irregular com valor de circularidade de 0,82. A maioria dos neurônios induzidos pela linha 414C2 e pela linha de dois a oito foi positiva para FOXG1 nos dias 30 e 60. Neurônios positivos para FOXG1 raramente foram detectados em organoides ou neurônios cultivados em 2D derivados da linha dois a seis.
Nossos resultados sugerem que modelos organoides baseados em IPSC derivados de pacientes representam uma plataforma útil para estudar espelhos, mecanismos e para triagem de medicamentos. Nossos métodos convencionais, com curto tempo de cultivo e relação custo-benefício, oferecem ferramentas práticas para investigar a fisiopatologia do MELIS. Gostaríamos de buscar potenciais medicamentos para MELIS utilizando compostos com entregue ao paciente organizado no futuro.
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Visão Geral
Este estudo explora o uso de organoides cerebrais como modelo para a Encefalomiopatia Mitocondrial, Acidose Láctica e Episódios Semelhantes a AVC (MELAS). A pesquisa tem como objetivo compreender a fisiopatologia subjacente da MELAS e facilitar a triagem de fármacos por meio da tecnologia de organoides.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Descoberta de Fármacos
Antecedentes
- As doenças mitocondriais são complexas e difíceis de estudar.
- Os organoides fornecem um modelo relevante para investigar essas doenças.
- A heteroplasmia em genes causadores de doenças leva a expressões fenotípicas variadas.
- Ensaios de alto rendimento são essenciais para triagem eficaz de fármacos.
Objetivo do Estudo
- Investigar os mecanismos das doenças mitocondriais.
- Identificar fármacos terapêuticos potenciais para a síndrome MELAS.
- Utilizar organoides para triagem de fármacos em alta produtividade.
Métodos Utilizados
- Cultura de células-tronco pluripotentes induzidas.
- Técnicas de formação de organoides.
- Desenvolvimento de ensaios de alto rendimento.
- Análise fenotípica de organoides.
Resultados Principais
- Os organoides exibem diferenças fenotípicas significativas com base nos níveis de heteroplasmia.
- Foram obtidas informações sobre a fisiopatologia da síndrome MELAS.
- Plataformas de triagem de fármacos foram estabelecidas utilizando modelos de organoides.
- Candidatos terapêuticos potenciais foram identificados.
Conclusões
- Os organoides cerebrais são modelos eficazes para o estudo da Síndrome MELAS.
- Eles fornecem informações valiosas sobre os mecanismos das doenças mitocondriais.
- Esses modelos facilitam a identificação de novas estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Organoides cerebrais derivados de pacientes que modelam a Síndrome MELAS permitem a desvinculação mecanicista de riscos e a validação de alvos para o descobrimento de fármacos para doenças mitocondriais. Esta plataforma oferece confiança preditiva na triagem de estágios iniciais ao reproduzir fenótipos relevantes para a doença associados à heteroplasmia mitocondrial. A abordagem promove a continuidade translacional desde a descoberta até a avaliação pré-clínica de doenças neurológicas raras.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Permite a investigação da disfunção mitocondrial e da formação de redes neurais em um sistema relevante para humanos.
- Apoia a validação funcional de alvos ao correlacionar níveis de heteroplasmia com desfechos fenotípicos.
- Facilita a desmistificação mecanicista de hipóteses sobre doenças mitocondriais.
- Oferece uma plataforma para triagem de alvos candidatos com base em leituras relevantes para a doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Fornece sistemas padronizados de organoides e neurônios em 2D para avaliação reprodutível de compostos.
- Permite triagem de alta produtividade de fármacos utilizando neurônios dissociados de organoides derivados de pacientes.
- Oferece suporte para avaliação quantitativa da eficiência de indução neural e formação de redes.
- Prepara modelos biológicos validados para fluxos de trabalho de triagem escaláveis.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha a modelagem de doenças com os contextos genéticos específicos do paciente para o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Mantém a continuidade da descoberta baseada em iPSCs até a validação pré-clínica em sistemas relevantes para a doença.
- Reduz o risco translacional ao modelar relações genótipo-fenótipo in vitro.
- Permite o avanço ajustado ao risco de candidatos terapêuticos para distúrbios mitocondriais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Essa abordagem de modelagem baseada em organoides integra a descoberta inicial, a identificação de compostos promissores e a pesquisa pré-clínica para doenças mitocondriais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias relacionadas à disfunção mitocondrial em tecidos neurais.
- Triagem: Fornece sistemas prontos para ensaios e reprodutíveis para avaliação quantitativa de fármacos.
- Análises: Permite a medição do tamanho e da morfologia de organoides, da indução neural e da formação de redes como parâmetros quantitativos.
- Pesquisa Translacional: Conecta perfis genéticos derivados de pacientes à modelagem pré-clínica de doenças e ao alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para estudos mecanicistas e triagem de compostos em programas de doenças mitocondriais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na modelagem de doenças mitocondriais.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos para geração de organoides e preparação para triagem de alto rendimento.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de riscos em hipóteses terapêuticas.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos direcionados a patologias mitocondriais.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cultura de iPSCs, formação de organoides e diferenciação neuronal.
- Requer acesso a equipamentos de cultura celular, microscopia e PCR quantitativa.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade em ensaios com organoides e neurônios em 2D.
- Pode exigir adaptação para diferentes variantes mitocondriais ou modelos de doenças.
- As limitações práticas incluem tempo de cultura, quantificação de heteroplasmia e escalabilidade para bibliotecas grandes de compostos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Generation of Cerebral Organoids and Early Differentiation
3:34
Dissociation of Cerebral Organoids and Seeding for 2D Neuronal Culture
5:14
Fixation and Collection of Cerebral Organoids and Cells for Immunofluorescence and RT-qPCR
6:49
Results
8:18
Conclusion
