Caracterização da secreção de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos usando um modelo de camundongo repórter CD63-GFP In Vivo e In Vitro

Estudamos vesículas extracelulares derivadas de adipócitos, EVs, para definir seus papéis no tecido adiposo, especialmente como regulam a comunicação entre adipócitos maduros e suas células progenitoras. Atualmente, não existem sistemas in vivo para estudar as secreções de EV de adipócitos, e os protocolos de purificação existentes ainda não estão totalmente otimizados. Para começar, use uma técnica estéril para extirpar tecido adiposo inguinal de camundongos eutanasiados.

Coloque um grama de tecido em um tubo de dois mililitros contendo 0,5 mililitro de tampão digestivo. Usando tesoura estéril, triture o tecido em pedaços não maiores que um milímetro. Suspenda o tecido picado em 10 mililitros de tampão digestivo contendo 0,5 miligramas por mililitro de Liberase e 50 unidades por mililitro de DNase I. Incube a amostra a 37 graus Celsius em um agitador orbital.

Durante a incubação, inverta suavemente o tubo várias vezes. Quando a solução aparece turva e não restam fragmentos visíveis de tecido, a digestão está completa. Para isolar a fração vascular estromal, ou SVF, dilua a suspensão digerida com dois volumes de buffer digestivo.

Inverta suavemente o tubo três a quatro vezes para misturar bem. Passe a suspensão por um filtro estéril de 100 micrômetros para remover tecido não digerido, depois centrifuge o filtrado a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Rotule o pellet como SVF.

Incube a fração vascular estromal em um tampão de lise de glóbulos vermelhos recém-preparado sobre gelo por cinco minutos, protegido da luz. Adicione dois volumes de buffer de lavagem e centrifuge a 400g por cinco minutos a quatro graus Celsius. Resuspenda a fração vascular estromal em 80 microlitros de tampão por grama de tecido e transfira o conteúdo para um novo tubo.

Adicione 20 microlitros de coquetel de depleção de progenitores não adipócitos por grama de tecido. Incube a amostra por 15 minutos a dois a oito graus Celsius no escuro. Passe a amostra por uma coluna LS e colete o fluxo que contém a fração celular negativa da linhagem.

Centrifuge o fluxo a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius para obter as células progenitoras dos adipócitos. Incubar 250 microlitros de células progenitoras isoladas de adipócitos de camundongos em lâminas de câmara de oito poços revestidas com colágeno por seis horas. Fixe as células com 4% de paraformaldeído por 10 minutos para preservar as estruturas celulares e extracelulares das vesículas para a imagem.

Em seguida, lave os slides três vezes com PBS e depois monte com meio anti-descoloração. Em seguida, após contar as células progenitoras dos adipócitos, suspenda-as e dilua o corante de viabilidade. Incube no gelo por 20 minutos, protegido da luz.

Lave as células uma vez com o buffer de lavagem e a centrífuga. Suspenda as células em um tampão de coloração brilhante para que a concentração final seja de 1 milhão de células por 100 microlitros. Bloqueie a ligação inespecífica adicionando um reagente bloqueador do receptor Fc na proporção de um para 100 e incube.

Gire livremente o anticorpo SCA-1 a 6000g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Adicione o anticorpo SCA-1 ao tubo APC com diluição de um a 100, depois coloque o tubo sobre gelo, protegido da luz. Lave as células duas vezes com um mililitro de tampão de lavagem, depois centrifuge a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Suspenda as células em buffer de lavagem para a classificação da citometria de fluxo, depois adquira os dados para células SCA-1 positivas e GFP positivas em um citômetro de fluxo espectral equipado com laser violeta e azul. Para começar a diferenciação, recubra as placas com gelatina 0,2% por 30 minutos em temperatura ambiente. Semeie APCs recém-isolados em meio suplementado DMEM/F12 e incube até a confluência.

Substitua o meio do primeiro ao oitavo dia pelo meio de diferenciação adipogênica MesenCult. No nono dia, lave os adipócitos duas vezes com PBS e depois substitua o meio por meio maduro contendo DMEM 1%BSA e 0,2% Primocina. Para isolar vesículas extracelulares secretadas por adipócitos, primeiro passe 15 mililitros de meio de cultura por um filtro de 40 micrômetros, seguido por um filtro de 30 micrômetros.

Centrifuge o filtrado a 500g por cinco minutos e depois centrifuge o sobrenadante a 2000g por 10 minutos para remover quaisquer células residuais e detritos. Após passar o sobrenadante resultante por um filtro de 0,8 micrômetro e transferir o filtrado para uma unidade de ultrafiltração de 15 mililitros, centrifuge a 4000g por 15 minutos para concentrar o meio. Carregue a amostra concentrada em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho conectada a um coletor automático de frações e colete frações F1 a F8.To realize a análise por Western blot, concentrando cada fração de 400 microlitros a 25 microlitros.

Pipete 50 microlitros de tampão de radioimunoprecipitação suplementado com protease e inibidores de fosfatase ao concentrado. Adicione 75 microlitros de dois tampões de carga 2X SDS para desnaturar a amostra e resolver proteínas em um gel de Tris-Glicina de 4% a 12%. Para análise de rastreamento de nanopartículas, dilua amostras de vesículas extracelulares com PBS estéril filtrado de 0,1 micrômetro e misture suavemente.

Carregue a amostra diluída no instrumento NTA equipado com uma câmera semicondutora científica complementar de óxido metálico de alta sensibilidade e um laser verde de 532 nanômetros. Ajuste a detecção para partículas entre 10 nanômetros e 1.000 nanômetros, e dentro de uma concentração de 10 até a potência de seis a 10 para a potência de nove partículas por mililitro. Células progenitoras adiposas de camundongos stop-flock/CD63GFP não apresentaram pontos fluorescentes verdes detectáveis sob microscopia confocal.

Enquanto células de camundongos AdipCD63 apresentavam numerosos pontos proteicos fluorescentes verdes distintos em todo o citoplasma. A análise de citometria de fluxo mostrou que 1,2% das células positivas do crânio 1 nos camundongos repórter expressaram proteína fluorescente verde, em comparação com 12,6% em camundongos AdipCD63-GFP. O Western blot das frações de cromatografia de exclusão de tamanho mostrou que os marcadores vesículas extracelulares CD63 e HSP70 foram enriquecidos nas frações F1 e F2. Enquanto marcadores de retículo endoplasmático e mitocôndrias estavam ausentes, confirmando a pureza vesical.

A análise de rastreamento de nanopartículas revelou que vesículas extracelulares derivadas de adipócitos variavam de 50 nanômetros a 500 nanômetros, e a microscopia eletrônica de transmissão confirmou que as vesículas apresentavam estruturas de membrana dupla intactas. Western blot confirmado nocaute de STX4 em adipócitos. A microscopia confocal mostrou que as vesículas CD63-GFP positivas estavam dispersas por todo o citosol em adipócitos do tipo selvagem, mas se acumulavam próximas à membrana plasmática nos adipócitos knockout de STX4.

A concentração de vesículas extracelulares derivadas de adipócitos secretadas foi significativamente reduzida nos adipócitos knockout STX4 em comparação com o tipo selvagem. Western blot de quantidades iguais de proteína de vesículas intracelulares apresentou redução na expressão de CD63 e CD81 nos adipócitos knockout STX4 em comparação com o tipo selvagem. O protocolo oferece um sistema robusto e reproduzível para estudar a secreção de EV de adipócitos in vivo e in vitro, além de um método otimizado de purificação de EVs de adipócitos.

O protocolo, pela primeira vez, descreve e valida o uso de centrifugações seriais de baixa velocidade combinadas com cromatografia de exclusão de tamanho para purificar EVs derivados de adipócitos maduros. Nossas descobertas nos permitem fazer novas perguntas sobre como os adipócitos utilizam vesículas extracelulares para se comunicar com outros tipos celulares sob condições fisiológicas e patológicas.