Imagem Espectroscópica de Super-resolução de Moléculas de DNA usando Contraste Intrínseco

Nossa pesquisa apresenta o primeiro protocolo para medição de espectros fluorescentes intrínsecos de moléculas de DNA, permitindo a investigação de suas propriedades ópticas nativas e características relacionadas à confirmação de sequências. Este protocolo explora a fluorescência endógena para imagens espectroscópicas de DNA, evitando a interrupção induzida da marcação, erro de ligação e densidade de marcação inconsistente nos métodos existentes. Para começar, dissolve a amostra de DNA em água desionizada sem nuclease até uma concentração final de 100 milimolares.

Prepare alíquotas de cinco microlitros da solução de DNA para minimizar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Armazene os tubos extras que contêm solução original a 4 graus Celsius. Usando um lenço de laboratório, limpe suavemente uma lâmina de vidro.

Pipete cinco microlitros da solução de DNA de 100 milimolares sobre a lâmina de vidro recém-limpa e deixe a amostra secar por uma a três horas para formar um gel de DNA. Em uma exaustão, prepare tanto o buffer beta-mercaptoetanol quanto o buffer de imagem DABCO para suportar a troca estocástica de fotos das moléculas de DNA. Pipete cinco microlitros do tampão de imagem sobre o gel de DNA e coloque uma capa de cobertura sobre a amostra.

Se houver bolhas dentro da amostra coberta, use uma pinça para removê-las. Obtenha um arranjo de nanoburacos fabricado contendo buracos de 100 nanômetros de diâmetro, espaçados quatro micrômetros entre si, dispostos em oito fileiras e cinco colunas. Ligue o sistema sSMLM e insira filtros de largura de banda estreita diretamente na frente da câmera.

Coloque a amostra de calibração sob um microscópio e acenda a lâmpada do microscópio para iluminar a amostra. Defina o tempo de exposição para 200 milissegundos para todos os filtros, mas mude para 2.000 milissegundos para o filtro de 750 nanômetros. Vá para adquirir um time lapse rápido para ajustar o número de quadros para 10 para cada filtro.

Após a calibração, carregue a amostra de gel de DNA no palco do microscópio com o lado deslizante da tampa voltado para o objetivo e abra o software da câmera para aquisição de dados. Identifique a posição Z apropriada usando o sistema automático de rastreamento de foco e ajuste o foco até que um piscar estocástico claro fique visível. Certifique-se de que o objetivo não toque na borda de deslizamento da tampa para evitar vazamento do amortecedor para o óleo de imersão e interferência com o rastreamento.

Adquira cerca de 10.000 a 30.000 quadros com o poder de iluminação desejado e um tempo de exposição de 30 milissegundos. Após a aquisição dos dados, permita que o software salve os dados no formato nd2 por padrão. Descarte o lâmina de vidro em uma lixeira aprovada designada para vidro quebrado ou itens cortantes.

Descarte todos os tampões restantes no recipiente designado para resíduos líquidos químicos, conforme as diretrizes institucionais de segurança. Abra Fiji e use o plugin bio formats para carregar a pilha de imagens brutas adquiridas da amostra de DNA. Selecione a imagem seguida de pilhas, Z Project, e escolha a intensidade mínima como tipo de projeção para gerar a projeção mínima da pilha de imagens brutas.

Selecione a calculadora de imagem e subtraia a projeção mínima da pilha de imagens brutas. Salve o conjunto de dados subtraído em segundo plano como um arquivo TIF para análise espectral. Em seguida, realize a identificação de localização na pilha de imagens brutas de ordem zero usando o plugin ThunderSTORM versão 1.3.

Defina o limiar para 1,2 vezes a onda de desvio padrão. F1, ajustando o raio a três, e sigma a 1,5 para reconstruir a imagem de ordem zero e extrair as coordenadas do evento de emissão. Para a pilha de imagens brutas de ordem zero cortada, selecione o plugin seguido de ThunderSTORM e execute a análise.

Use Fiji e o software open source RainbowSTORM com a versão MATLAB mais recente que 2020b para processar os dados de calibração e obter a relação entre deslocamentos horizontais e verticais e comprimentos de onda. Realize a identificação de localização nas imagens de calibração dos cinco comprimentos de onda usando o plugin ThunderSTORM. Defina o limiar para cinco vezes o desvio padrão, onda.

F1, ajustando raio a três, e sigma a 1,5 para reconstruir localizações de nanoburacos na ordem zero e localizações espectrais correspondentes na primeira ordem. Obtenha uma imagem média de cada dado de calibração e ajuste o limiar dentro de uma faixa de cinco a dez vezes a onda de desvio padrão. F1 até 80 localizações são obtidas para cada imagem de calibração.

Execute o RainbowSTORM e clique em navegar sob calibração espectral para carregar os arquivos CSV de cada comprimento de onda de calibração. Depois, clique em salvar o arquivo de calibração para armazenar o arquivo de calibração. Use o script Python personalizado versão 3.11.7 para extrair os dados do espectro completo.

Depois, defina os caminhos corretos de arquivo no script Python para a pilha de imagens subtraídas em segundo plano no formato TIF da etapa anterior de subtração de fundo. Defina o caminho do arquivo para o arquivo CSV de localização produzido a partir da etapa de análise de localização e para o arquivo de calibração no formato MAT gerado a partir da etapa de calibração. Depois, ajuste o deslocamento horizontal para 925 a 984 pixels para os dados de 532 nanômetros adquiridos com uma DWP 3D correspondente a uma janela espectral de 525 a 750 nanômetros para garantir cobertura além da faixa do filtro de 590 a 650 nanômetros.

Ajuste o deslocamento vertical para 23 pixels tanto para os dados de 488 nanômetros quanto de 532 nanômetros adquiridos com o DWP 3D com base na curva de calibração espectral obtida usando o RainbowSTORM. Por fim, linearize o espectro não linear usando um ajuste polinomial de terceira ordem para análise subsequente de comparação e classificação. A calibração espectral foi realizada, permitindo a medição dos correspondentes deslocamentos horizontais e verticais dos pixels entre as imagens de ordem zero e de primeira ordem.

Isso permitiu o mapeamento de uma curva de calibração entre a posição do pixel e o comprimento de onda. Os espectros de emissão não linear e o linear convertido sob excitação de 532 nanômetros foram obtidos para o alter GC, que se refere a um tipo de molécula de DNA de fita dupla. A curva verde representava o espectro médio.

Os espectros de emissão não lineares e lineares convertidos do A10C10, um tipo de molécula de DNA de fita simples, foram obtidos sob excitação de 488 nanômetros, com a curva azul representando o espectro médio. Esse protocolo permite que pesquisadores meçam espectros fluorescentes intrínsecos de moléculas de DNA de fita simples e dupla sintetizadas com imagem espectroscópica de super resolução. Localizar com precisão a posição Z correta é fundamental, pois as amostras de gel de DNA carecem de informações estruturais e exigem foco cuidadoso para observar os piscades estocásticos.

Trabalhos futuros podem se estender à medição da fluorescência intrínseca do RNA e da proteína, integrando modelos computacionais para predição de sequências e imagem por cromatina livre de marcação.