In Vitro Análise Funcional de Células T Reguladoras: Foco na Proliferação e Diferenciação

Nosso laboratório estudou a diferenciação, metabolismo e interação de subconjuntos de células T. O Treg afeta a diafonia das células T, mantém a homeostase imune, tornando a pesquisa com Treg crucial para o tratamento de doenças autoimunes e inflamatórias. Ensaios tradicionais in vitro de supressão Treg negligenciaram os efeitos mediados pelo Treg e a diferenciação das células T efetoras.

Esse protocolo modificado avalia simultaneamente a proliferação e a polarização. Para começar, prepare células T naïf, células regulatórias enriquecidas com T ou Treg, e células não CD4 positivas enriquecidas com antígenos. Centrifuge a suspensão naïve de células T CD4-positivas a 350G por sete minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante para obter a cápsula celular.

Dilua o corante de proliferação celular eFluor 450 em PBS para obter uma concentração de 20 micromolares em temperatura ambiente. Adicione 0,5 mililitros de PBS por um vezes 10 à potência de sete células no tubo. Mantenha o tubo inclinado aproximadamente 45 graus e ressuspenda suavemente as células pipetando para cima e para baixo 50 vezes.

Em seguida, adicione rapidamente um volume igual da solução de corante de proliferação celular na suspensão celular para obter uma concentração final de 10 micromolares. Segure o tubo em um ângulo de 45 graus e pipete as células para misturá-las bem com o corante de proliferação celular. Imediatamente envolva o tubo da centrífuga com papel alumínio para evitar exposição à luz.

Incube em temperatura ambiente por 20 minutos enquanto as vórtice suavemente a cada cinco minutos para evitar a agregação celular. Em seguida, adicione 10 mililitros de meio de cultura celular pré-resfriado ao tubo da centrífuga e faça um vórtice suave nas células para terminar a coloração. Depois, centrifuge as células e descarte o sobrenadante.

Para lavar as células, adicione cinco mililitros de meio de cultura celular pré-resfriado ao pellet celular. Repita a centrifugação e resuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de cultivo. Após a contagem celular, centrifuge-as e ressuspenda-as em um volume apropriado de meio de cultivo para alcançar uma concentração celular de duas vezes 10 elevado à potência de seis células por mililitro.

Mantenha o tubo no gelo. Calcule o número de amostras necessárias para a cultura celular. Prepare uma quantidade adequada de meio de cultura celular contendo 2,5 microgramas por mililitro anticorpo anti-camundongo CD3 ou as citocinas de indução adequadas.

Pegue células T ingênuas preparadas e células enriquecidas com Treg e faça um vórtice. Adicione 100 microlitros de células T naïves positivas para CD45,2, células T positivas para CD4 e 100 microlitros de células não positivas para APC enriquecidas com CD45,1 positivas para CD45,1 à placa de 48 poços. Transfira 100 microlitros de células enriquecidas com Treg CD45.1 positivo, CD4 positivo e CD25 positivo para os poços experimentais e 100 microlitros de meio de cultura celular para os poços de controle.

Em seguida, pipetei 100 microlitros de meio de cultivo contendo anticorpo anti-camundongo CD3 e 100 microlitros de meio de cultivo contendo as citocinas de indução adequadas em cada poço. Adicione PBS aos poços vazios restantes para manter a umidade da placa e reduzir os efeitos de borda. Incube a placa de 48 poços em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por três dias.

Pipetee suavemente as células cultivadas para ressuspendê-las e transfira a suspensão para um tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Centrifuge as células e remova o sobrenadante. Adicione 500 microlitros de meio de cultura celular contendo forbol 12-miristato 13-acetato, ionomicina e inibidor de transporte proteico GolgiPlug a cada tubo.

Leve um vórtice para ressuspender as células e incubá-las em uma incubadora de dióxido de carbono a 5% a 37 graus Celsius por três horas. Após a centrifugação, adicione 50 microlitros de PBS contendo um teste de corante amarelo zumbi e 1:100 anticorpos anti-camundongos diluídos CD16 ou 32 ao pellet. Faça vórtice nas amostras e incube em temperatura ambiente no escuro por 15 minutos para marcar células mortas e bloquear os receptores FC.

Centrifuge as células antes de descartar o sobrenadante. Adicione 50 microlitros de coquetel de anticorpos de superfície à amostra, faça um vórtice e incube a quatro graus Celsius no escuro por 20 minutos. Depois, adicione um mililitro de tampão de filtragem de células ativadas por fluorescência ou FACS a cada tubo da centrífuga.

Após centrifugação e remoção do sobrenadante, adicione 300 microlitros de solução de fixação e permeabilização a cada tubo da centrífuga e faça vórtice nas amostras. Incube as amostras a quatro graus Celsius no escuro por 20 minutos. Transferir mililitros de permeabilização e tampão de lavagem para cada tubo da centrífuga, seguido pela centrifugação e remoção do sobrenadante.

Após repetir a lavagem, adicione 50 microlitros de coquetel de anticorpos de citocinas a cada amostra e faça um vórtice nas amostras. Incube as amostras a quatro graus Celsius no escuro por 40 minutos. Lave cada amostra com um mililitro de permeabilização e lave o tampão.

Centrifuge as células e remova o sobrenadante. Resuspenda o pellet celular em 300 microlitros de tampão FACS. Meça a proliferação e diferenciação das células T respondentes por citometria de fluxo.

Bloqueie a população de linfócitos entre as células totais para excluir detritos e impurezas celulares. Selecione a população unicelular entre os linfócitos com base nos sinais de dispersão. Em seguida, identifique a população de células vivas entre as células individuais, seguida pela população de células T CD4 positivas entre as células vivas.

Em seguida, faça o gate da população enriquecida com células T reguladoras CD45,1 positivas e da população de células T efetoras CD45,2 positivas entre as células T CD4 positivas. Em seguida, selecione as células auxiliares T 1 positivas para interferon em CD4 positivo para CD45,2, as células auxiliares T positivas para CD45,2 positivas para CD44 positivas para CD45,2 e as células T CD4 positivas para CD45,2 não proliferadas entre as células T positivas para CD45,2. Realize a aquisição de dados de citometria de fluxo para todas as amostras.

Por fim, analise os dados de citometria de fluxo com o software FlowJo usando a mesma estratégia de gating da aquisição de dados de citometria de fluxo. A frequência de células T respondentes não proliferadas aumentou significativamente tanto sob as condições de indução de T helper 1 quanto de T helper 17 após co-cultura com células T enriquecidas com células T reguladoras. A diferenciação das células T helper 1 positivas para CD45.2, interferon gama positivo para CD4 e positivas para interferon 1 foi significativamente suprimida após co-cultura com células enriquecidas com células T regulatórias.

A frequência de células auxiliares T positivas para CD45,2 e interleucina-17A positivas para CD4 aumentaram quando células T respondentes foram cultivadas com células enriquecidas com células T reguladoras. A análise funcional in vitro das células Treg permite a investigação dos efeitos biodirecionais entre células T Treg e efetoras na proliferação e polarização. O maior desafio ao realizar esse protocolo é como manter a viabilidade celular garantindo a pureza das células Treg e das células T ingênuas.

Após esse processo, o ELISA e outros ensaios biomédicos podem avaliar a produção de citocinas e efetores metabólicos, enquanto células classificadas por FACS possibilitam análises posteriores de RNA-seq e proteômica.