Name: Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-21T19:19:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a realizar imunoprecipitação de cromatina em tecido cerebral humano pós-morte. Esta técnica mapeia metilação de histonas e reguladores epigenéticos, revelando mecanismos da expressão gênica em cérebros normais e doentes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde Mental (5R01MH071476).

Procedimento: 1 º dia 1. Homogeneizar 50-500 mg de tecido de matéria congelada post-mortem cinza com Douncing Buffer. ! ATENÇÃO - tecidos humanos devem ser manuseados com cuidado sob condições rígidas de segurança. Que deve ser manuseado em padrões NBS-2 ou superior de segurança. <ol><li> Tomar previamente dissecados, cérebro post-mortem de -80 ° C, Dounce-los em volume cerebral 5X de tampão Douncing, e colocar em tubo de microcentrífuga 2,0 mL. Matched amostra e pares de controle são processados ​​simultaneamente. </li></ol> 2. Micrococcal Nuclease (MN) Digestão <ol><li> Adicionar 5U/mL de Micrococcal nuclease para a amostra e misturar na solução pipetando cima e para baixo antes de colocar no gelo. * ETAPA CRÍTICA - É importante fazer este passo rapidamente desde MN tem a capacidade de atuar em até 4 ° C. </li><li> Incubar as amostras durante 7 minutos a 37 ° C. </li><li> Após a incubação 7 minutos, adicione EDTA 0,5 M a uma concentração de 10mM para parar a atividade MNase. </li></ol> 3. Hypotonisation <ol><li> Colocar as amostras em um tubo falcon 15 mL. Adicionar o volume de amostra de 0,2 mM 10X EDTA, 1 / 2000 volume de amostra de benzamidine 0,2 M e volume de amostra 1 / 1000 de phenylmethanesulphonylfluoride 0,1 M (PMSF). Os dois últimos compostos são usados ​​como inibidores da protease. * ETAPA CRÍTICA - É importante manter as amostras em gelo durante todos estes passos. </li><li> Incubar amostra por 1 hora, enquanto vórtex a cada 10 minutos. </li><li> No final da incubação hora de duração, adicionar volume de amostra 1 / 2000 da 3M TDT, outro inibidor da protease. </li><li> Amostra de vórtice, uma vez mais e centrifugar a 3175 RCF por 10 minutos a 4 ° C. * ETAPA OPCIONAL - Precleansing com proteína G Agarose. <ol><li> Tome sobrenadante e colocar em novo tubo falcon 15 mL. </li><li> Adicionar 500 mL da proteína G Agarose. </li><li> Girar em temperatura ambiente por 30 min. </li><li> Centrifugar a 4000 rpm por 10 min a 4 ° C. </li></ol></li><li> Distribuir sobrenadante para que 500 mL são usados ​​como controle de entrada (contendo DNA genômico apenas), eo restante é dividido em dois tubos contendo 1600 mL de amostra de cada um - que são de cromatina imunoprecipitação (CHIP) amostras. </li><li> O controle de entrada é colocada a -80 ° CO / N até à sua utilização. </li><li> Para as amostras de chip - adicionar o volume de 10XFSB 01:10 e 4μg de anticorpos, em seguida, as amostras vortex e gire-a 4 ° C durante a noite. ! ATENÇÃO - Quantidade e diluição de anticorpos pode exigir de otimização. </li></ol> 2 º Dia ! CUIDADO! - Begin 2 º dia lavando a proteína G Agarose que será usado para isolar DNA nucleosomal. Desde contas agarose são muito sensíveis, é necessário cortar as cabeças das dicas sempre pipetagem qualquer solução contendo esferas de agarose. 1. Sondagem Beads Proteína G Agarose para DNA <ol><li> Adicionar 1,6 mL para 245 mL 1XFSB proteína G-agarose (suficiente para 4 tubos) em um tubo de microcentrífuga de 2 mL (loop). </li><li> Separar a solução em dois tubos de 2 mL e encha cada uma com até 1,6 mL com 1X FSB. </li><li> Girar em RT por 30 segundos e centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg. </li><li> Retire o sobrenadante usando um vácuo. </li><li> Adicionar 1,6 mL 1X FSB mais uma vez. Gire as amostras por 30 segundos e depois centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg. </li><li> Remover o sobrenadante, mais uma vez, e combinar os dois tubos com 1,5 mL 1XFSB. </li><li> Adicionar 15 mL de DNA do esperma sonicado Salmon (10mg/mL). ! ATENÇÃO - Esta etapa deve, em princípio, reduzir a ligação não específica da immunoprecipitate às esferas. No entanto, isso também pode levar a falsos positivos para algumas das seqüências (humano) de DNA. </li><li> Girar em RT por 30 min, em seguida, centrifugar a 0,1 RCF por 30 seg. </li><li> Remover o sobrenadante. Adicionar 200 mL de 1XFSB. </li><li> Adicionar 90 mL de contas agarose em cada amostra ChIP. Gire a 4 ° C por 1 hora. </li><li> Adicione 1 ml de 1XFSB em grânulos restantes agarose para servir como controle negativo e gire a 4 ° C por 1 hora. </li><li> Após a incubação hora de duração, centrifugar as amostras e controle negativo em 0,1 RCF por 30 seg. Desprezar o sobrenadante. </li></ol> 2. Lavar as Beads ! CUIDADO! - Buffers de lavar roupa deve ser mantida a 4 ° C até o uso, e devem ser usados ​​apenas se estão a menos de um mês de idade. <ol><li> Adicionar 1 mL de cada solução de lavagem para as contas e rodar por 3 min à temperatura ambiente. </li><li> Centrífuga de 0,1 RCF por 30 seg. </li><li> Descarte de vácuo utilizando sobrenadante. </li></ol> * Cada solução de lavagem - Tampão de lavagem Low sal - Tampão de lavagem de alta sal </p&gt; - Solução de cloreto de lítio - apenas giram a RT por 1 minuto! - Tampão TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH = 8) 3. Eluição * ETAPA CRÍTICA - Faça tampão de eluição frescos para cada experimento no dia em que está a ser utilizado. <ol><li> Adicionar 250 mL de tampão de eluição preparada para cada amostra. </li><li> Rodar por 15 min à temperatura ambiente, então centrifugue a 0,4 RCF por 1 min. </li><li> Salve o sobrenadante em um tubo de microcentrífuga de 2,0 mL (Loop). </li><li> Adicionar 250 mL de tampão de eluição de cada amostra e vortex à mão por alguns segundos. Então, amostras vortex por 15 minutos em um mulitvortexer. </li><li> Centrifugar a 16 RCF rpm por 4 minutos e guarde o sobrenadante em 2,0 mL mesmo tubo (Loop). </li></ol> 4. Proteína Digest <ol><li> Adicionar 10 ml de EDTA 0,5 M, 25 mL 0,8 M Tris-HCl, pH 6,5, 10 mg / ml Proteinase K (1 / 200 da amostra) para cada amostra ChIP. </li><li> Para cada controle de entrada, adicionar tampão de lise para a digestão proteinase K (1 / 10 de tampão da amostra) e proteinase K 10mg/ml (1 / 200 de tampão da amostra). </li><li> Entrada e incubar amostras de chip em 52 ° C por pelo menos 3 horas. </li></ol> 5. Fenol / clorofórmio extração ! ATENÇÃO - Experiment exigindo fenol / clorofórmio deve ser realizada sob o capô. Use luvas de borracha nitrílica ao manusear fenol / clorofórmio. <ol><li> Após a incubação de 3 horas, nós adicionamos os 500 mL de fenol-clorofórmio para cada amostra. </li><li> Vortex todas as amostras durante vários segundos, em seguida, centrifugar a 13 rpm RCF por 5 min. </li><li> Neste ponto, duas fases estarão presentes e nós estamos interessados ​​no conteúdo da fase de topo. Retire a fase superior e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga de 2 mL. </li><li> Adicionar uma mistura de 2μL de glicogênio e 50μL de acetato de sódio 3M para cada amostra, juntamente com 1,375 mL de etanol 100%. </li><li> Vortex vigorosamente todas as amostras. Colocá-los em -80 ° C durante a noite. </li></ol> 3 º dia <ol><li> Remover amostras forma -80 ° C e colocá-los no gelo para eles a descongelar. </li><li> Centrifugar a 15 RCF por 10 minutos a 4 ° C. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 1 mL de etanol 75% frio para cada amostra, em seguida, inverter-los 4-6 vezes. </li><li> Centrifugar a 18 RCF por 5 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante, uma vez mais e permitir que as pelotas para o ar seco. </li><li> Dissolver pellets secos em 50 mL de 4mm Tris-HCl, PH8 e armazenar a -80 ° C até à sua utilização. </li></ol>

<ol><li>Huang, H. S., Matevossian, A., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akbarian+S.+Chromatin+immunoprecipitation+in+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Akbarian S. Chromatin immunoprecipitation in postmortem brain.</a> J Neurosci Methods. 156, 284-292 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. S., Matevossian, A., Whittle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+dysfunction+in+schizophrenia+involves+mixed-lineage+leukemia+1-regulated+histone+methylation+at+GABAergic+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal dysfunction in schizophrenia involves mixed-lineage leukemia 1-regulated histone methylation at GABAergic gene promoters.</a> J Neurosci. 27, 11254-11262 Forthcoming.</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprecipitation+of+native+chromatin%3A+NChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31, 76-82 Forthcoming.</li>
<li>Spiteri, E., Konopka, G., Coppola, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcriptional+targets+of+FOXP2%2C+a+gene+linked+to+speech+and+language%2C+in+developing+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcriptional targets of FOXP2, a gene linked to speech and language, in developing human brain.</a> Am J Hum Genet. 81, 1144-1157 Forthcoming.</li>
<li>Huang, H. uang, Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAD1+mRNA+expression+and+DNA+methylation+in+prefrontal+cortex+of+subjects+with+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">GAD1 mRNA expression and DNA methylation in prefrontal cortex of subjects with schizophrenia.</a> PLoS ONE. 2, Forthcoming.</li>
<li>Stadler, F., Kolb, G., Rubusch, L., Baker, S. P., Jones, E. G., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+at+gene+promoters+is+associated+with+developmental+regulation+and+region-specific+expression+of+ionotropic+and+metabotropic+glutamate+receptors+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Histone methylation at gene promoters is associated with developmental regulation and region-specific expression of ionotropic and metabotropic glutamate receptors in human brain.</a> J Neurochem. 94, 324-336 Forthcoming.</li>
</ol>

O protocolo apresentado aqui é particularmente útil para os pesquisadores interessados ​​em assinaturas de metilação das histonas e / ou DNA do cérebro humano, porque essas marcas cromatina pode ser menos propenso a artefatos pós-morte, em comparação com outros tipos de modificações, incluindo (histonas) acetilação e fosforilação 1, 2. O cérebro pós-morte é passível de estudo da mono-nucleosomal preparados; o DNA permanece em grande parte ligado à histonas do núcleo, pelo menos em amostras com intervalos de autólise representante...

Soluções: <ul><li> nChIP buffer Douncing: 10 mM Tris, 4 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2 ajustar o pH para 7,5 </li><li> 10x FSB: 50 mM EDTA, 200 mM Tris, 500 mM NaCl ajustar o pH para 7,5 </li><li> Buffer de baixo teor de sal de lavagem: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 150 mM NaCl </li><li> Tampão de lavagem de sal elevado: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 8), 500 mM NaCl </li><li> Tampão de lítio Cloreto: 1% IGEPAL-CA 630, 1% de ácido deoxicólico, 1 mM EDTA (pH 8), 10 mM Tris (pH 8), 0,25 M LiCl </li><li> TE buffer: 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA </li><li> Tampão eluição: NaHCO 3 0,1 M, SDS 1% </li><li> Proteinase K tampão de digestão (10X): 1M Tris, 50 mM EDTA, 2% SDS, NaCl 2M ajustar o pH para 8,0 </li><li> 3 acetato de sódio M: 24,61 g de acetato de sódio anidro (MW = 82,03) em 100 mL de água destilada autoclavada. Ajustar o pH de 5,2 utilizando ácido acético concentrados. </li></ul>

um ensaio chromatin para tecido do cérebro humano

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Crônica doenças neuropsiquiátricas como a esquizofrenia, doença bipolar e autismo são pensados ​​para resultar de uma combinação de fatores genéticos e ambientais que podem resultar em alterações epigenéticas da expressão gênica e outra patologia molecular. Tradicionalmente, no entanto, estudos de expressão no cérebro pós-morte foram confinados a quantificação de mRNA ou da proteína. As limitações encontradas na investigação pós-morte do cérebro, como variabilidades no tempo autólise e integridades tecidos também são susceptíveis de impacto a todos os estudos de estruturas de maior cromatina ordem. No entanto, a organização nucleosomal de DNA genômico, incluindo DNA: núcleo da histona vinculativo - parece ser em grande parte preservados em amostras representativas prestados pelos bancos cérebro diferentes. Portanto, é possível estudar o padrão de metilação e outras modificações covalentes das histonas no núcleo definido loci genômicos no cérebro pós-morte. Aqui, apresentamos uma versão simplificada nativa imunoprecipitação da cromatina protocolo (NChIP) para amostras congeladas (nunca fixo) cérebro humano. Começando com micrococcal digestão nuclease de homogeneizados de cérebro, NChIP seguido por qPCR pode ser concluída dentro de três dias. A metodologia apresentada aqui deve ser útil para elucidar os mecanismos epigenéticos de expressão gênica em normais e doentes cérebro humano.

Até recentemente, estudos de expressão no cérebro humano eram limitados a quantificação de RNA ou proteína. Com as técnicas de imunoprecipitação de cromatina descritas neste documento, será possível mapear a metilação da histona e outros reguladores epigenética da expressão gênica no cérebro pós-morte.

Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Doenças neuropsiquiátricas crônicas, como a esquizofrenia, o transtorno bipolar e o autismo, acredita-se que resultem de uma combinação de fatores genéticos e ambientais...

Olá, eu sou Amish Matan e sou do laboratório da Dra. Sha Mc Barian aqui no departamento de psiquiatria da Escola de Medicina UMass. Hoje vou mostrar um procedimento de imunoprecipitação de cromatina em tecido cerebral humano pós-mortem. Embora o procedimento a seguir não seja muito complicado.O mais empolgante é que, até recentemente, os estudos de expressão no cérebro humano estavam limitados à simples quantificação de mRNA e proteínas. Esta técnica específica nos proporcionará uma compreensão mais profunda da base mecanicista da expressão gênica tanto no cérebro humano normal quanto no doente. Então, vamos começar a imunoprecipitar a cromatina.Começamos com amostras previamente dissecadas de tecido cerebral humano postmortem congelado. É importante usar óculos de proteção e trabalhar em uma área designada para o manuseio de tecido humano. Ao processar essas amostras, o tecido cerebral é submerso em um volume de tampão de sedimentação equivalente a cinco vezes o volume do cérebro.Uma vez que todo o tecido pareça ter se tornado homogêneo na solução, podemos transferi-lo para um tubo de dois mil. Após a homogeneização do tecido, adicione cinco unidades por mil de micrococcal nucleas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Este protocolo descreve como imunoprecipitação da cromatina (chip) é usado para estudar as alterações dinâmicas ao modelo de cromatina que regulam a transcrição induzida por uma via de transdução de sinal.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

Fonte: Mendez, F. M. et al., Imunoprecipitação de cromatina nativa usando neuroesferas de tumor cerebral murino. J. Vis. Exp. (2018). Este vídeo demonstra o isolamento de complexos proteína-DNA de células neuroesféricas derivadas de um tumor cerebral de camundongo usando imunoprecipitação de cromatina nativa. Ele detalha as etapas de preparação da cromatina, imunoprecipitação, lavagem e digestão de proteínas para liberar DNA para análise posterior.

Imunoprecipitação da cromatina nativa de células da neuroesfera

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Aqui descrevemos um método imunoquímico sensível para mapear a distribuição espacial de derivados de oxidação de 5mC com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação de sinal de tiramida.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

Mecanismos epigenéticos são frequentemente alterados no glioma. Imunoprecipitação da cromatina pode ser usada para estudar as consequências de alterações genéticas no glioma que resultam de mudanças nas modificações do histone que regulam a transcrição de gene e a estrutura da cromatina. Este protocolo descreve imunoprecipitação da cromatina nativa na neurospheres de tumor murino de cérebro.

Imunoprecipitação da cromatina nativa usando Neurospheres de Tumor de cérebro murino

Descreveremos um protocolo passo a passo para cromatina em tandem da imunoprecipitação sequenciamento (tChIP-Seq) que permite a análise da modificação do histone todo o genoma de célula tipo-específicas.

TChIP-Seq: Epigenoma célula tipo-específicas de criação de perfil

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Aprenda a realizar imunoprecipitação de cromatina em tecido cerebral humano pós-morte. Esta técnica mapeia metilação de histonas e reguladores epigenéticos, revelando mecanismos da expressão gênica em cérebros normais e doentes.

Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Explorar mais vídeos