Um Ensaio Chromatin para tecido do cérebro humano

Olá, eu sou Amish Matan e sou do laboratório da Dra. Sha Mc Barian aqui no departamento de psiquiatria da Escola de Medicina UMass. Hoje vou mostrar um procedimento de imunoprecipitação de cromatina em tecido cerebral humano pós-mortem. Embora o procedimento a seguir não seja muito complicado.

O mais empolgante é que, até recentemente, os estudos de expressão no cérebro humano estavam limitados à simples quantificação de mRNA e proteínas. Esta técnica específica nos proporcionará uma compreensão mais profunda da base mecanicista da expressão gênica tanto no cérebro humano normal quanto no doente. Então, vamos começar a imunoprecipitar a cromatina.

Começamos com amostras previamente dissecadas de tecido cerebral humano postmortem congelado. É importante usar óculos de proteção e trabalhar em uma área designada para o manuseio de tecido humano. Ao processar essas amostras, o tecido cerebral é submerso em um volume de tampão de sedimentação equivalente a cinco vezes o volume do cérebro.

Uma vez que todo o tecido pareça ter se tornado homogêneo na solução, podemos transferi-lo para um tubo de dois mil. Após a homogeneização do tecido, adicione cinco unidades por mil de micrococcal nuclease à amostra e misture a solução pipetando para cima e para baixo. Em seguida, coloque-o no gelo.

É importante realizar o passo rapidamente, pois a micrococcal nuclease tem a capacidade de agir mesmo a quatro graus Celsius. Assim que todas as amostras forem tratadas com micrococcal nuclease, passamos rapidamente para o banho-maria a 37 °C e incubamos as amostras por sete minutos.

Após a incubação de sete minutos, adicionamos EDTA 0,5 molar até uma concentração de 10 milimoles para interromper a atividade da micrococcal nuclease. Agora estamos prontos para prosseguir para a etapa de fragmentação. Após o tratamento com micrococcal nuclease, nossas amostras, que contêm o DNA nucleossômico, iniciarão a fragmentação.

Nava pegará um tubo Falcon de 15 mililitros no qual adicionaremos 4,5 mililitros de EDTA 0,2 milimolar, 2,5 microlitros de benadina 0,2 molar e 4,5 microlitros de PMSF 0,1 molar a este tubo. Transferiremos nossa amostra. Agora, incubaremos nossa amostra por uma hora em gelo, agitando-a no vórtex a cada 10 minutos.

Após a incubação de uma hora, adicionaremos 2,5 microlitros de DTT três molar. A amostra é vortexada mais uma vez e, em seguida, centrifugada em rotor de balde oscilante a 3.175 × g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, o sobrenadante é distribuído de modo que 500 microlitros sejam utilizados como nosso controle de entrada, que conterá apenas DNA genômico, e o restante é dividido em dois tubos contendo 1.600 microlitros de amostra cada, que serão nossas amostras de imunoprecipitação de cromatina.

O controle de entrada é colocado a menos 80 graus Celsius durante a noite até posterior utilização. Em seguida, adicionamos 160 microlitros de FSB 10 X, correspondente a um décimo do volume da nossa amostra. Juntamente com isso, adicionamos quatro microgramas do anticorpo.

Agora, agite as amostras em vórtex e, em seguida, gire-as a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna, lavaremos os giros proteicos que serão utilizados para isolar nosso DNA nucleossômico. Como essas microesferas de agarose são muito sensíveis, é necessário cortar as pontas das pipetas ao trabalhar com elas.

Isso garante que as esferas tenham mais espaço durante a pipetagem. Agora, adicione 1,6 mil de uma esfera XFS a 245 microlitros de proteína jaguars em um tubo de microcentrífuga de dois mil. Isso deve ser suficiente para quatro tubos de amostra.

Em seguida, separe a solução de microesferas em dois tubos de dois mililitros e reabasteça cada um até 1,6 mililitros com um XFSB. Incube os tubos em temperatura ambiente por 30 segundos em um agitador rotativo e, em seguida, centrifugue-os a 0,1 RCF durante 30 segundos. Após a centrifugação, remova o ATE utilizando um vácuo.

Adicione 1,6 mils de um XFSB. Novamente, gire as amostras por 30 segundos em um agitador rotativo e, em seguida, centrifugue-as novamente a 0,1 RCF FS por 30 segundos. Após a centrifugação, removemos mais uma vez o sobrenadante e combinamos ambos os tubos com 1,5 mils de um XFSB.

Adicione também 15 microlitros de DNA de espermatozoide. Agora, agite em temperatura ambiente por 30 minutos e, em seguida, centrifugue a 0,1 RCF por 30 segundos. Remova o sobrenadante e adicione 200 microlitros de FBS 1X.

Agora, adicione 90 microlitros de agro speeds a cada amostra de precipitação de cromatina e, em seguida, gire-as a quatro graus por uma hora. Como controle negativo, adicione um mililitro de um XFSB aos agro speeds restantes e gire junto com a amostra de imunoprecipitação de cromatina a quatro graus Celsius por uma hora. Durante a incubação de uma hora, podemos aproveitar para preparar um novo tampão de resolução.

Isso será usado posteriormente no experimento após uma hora. Centrifugue as amostras e o controle negativo a 0,1 CFS por 30 segundos e descarte o sobrenadante. Em seguida, lavaremos as esferas com quatro tipos diferentes de soluções de lavagem: um tampão de lavagem com baixa salinidade, um tampão de lavagem com alta salinidade, uma solução de cloreto de lítio e, finalmente, tampão TE em pH 8.

Para cada tampão, exceto a solução de cloreto de lítio, vamos rotacionar as amostras por três minutos à temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar por 30 segundos a 0,1 R Cs. Para a lavagem com cloreto de lítio, rotacione as amostras à temperatura ambiente por apenas um minuto. Após cada lavagem, descarte o sobrenadante utilizando vácuo.

Agora estamos prontos para prosseguir com a eluição das nossas amostras. Para iniciar a etapa de eluição, adicionamos 250 microlitros de tampão de eluição recém-preparado a cada amostra. Incube as amostras sob rotação por 15 minutos à temperatura ambiente, em seguida centrifugue a 0,4 RCF por um minuto.

Agora, guarde o sobrenadante em um tubo laranja de dois mil. Em seguida, adicione 250 microlitros de tampão de evolução a cada amostra. Mais uma vez, agite todos manualmente em vórtex por alguns segundos.

Em seguida, agite as amostras em vórtex por 15 minutos após agitar em vórtex por 15 minutos, centrifugue os tubos. Adicione 16 RCF por quatro minutos e guarde o sobrenadante no mesmo tubo de 2 mililitros. Para digerir a proteína nas nossas amostras, adicione primeiro 10 microlitros de A DTA 0,5 molar, 25 microlitros de twist HCL 0,8 molar a um pH de 6,5 e 2,5 microlitros de proteinase K a 10 miligramas por mililitro a cada amostra de imunoprecipitação de cromatina.

Adicione próximo a cada controle de entrada 15 microlitros de tampão de lise e 2,5 microlitros de proteinase K a 10 miligramas por ml. Incube ambas as amostras de entrada e de imunoprecipitação de cromatina a 52 graus Celsius por pelo menos três horas. Agora que a incubação de três horas terminou, podemos prosseguir e iniciar a extração com fenol clorofórmio.

Após a incubação de três horas, adicionamos 500 microlitros de fenil cloroformiato a cada amostra. Isso é feito na câmara de fluxo laminar devido ao fato de que o fenil cloroformiato é um composto orgânico nocivo tanto por contato com a pele quanto por inalação. Em seguida, agitamos todas as amostras em vórtex por vários segundos e as centrifugamos a 13 RCF durante cinco minutos após a centrifugação.

Devem estar presentes duas fases dentro dos tubos. Como estamos interessados no conteúdo da fase superior, vamos retirar a fase superior e colocá-la em um tubo microcentrífugo de dois mil. Em seguida, uma mistura de dois microlitros de glicogênio e 50 microlitros de acetato de sódio três molar é adicionada a cada amostra, juntamente com 1,375 mil de etanol a cem por cento.

Todas as amostras são vortexadas vigorosamente e colocadas a menos 80 graus Celsius durante a noite. Após a incubação noturna, as amostras são colocadas sobre gelo para descongelar. São centrifugadas em alta velocidade a 15 RCF durante 10 minutos a quatro graus Celsius.

Após a centrifugação, remova cuidadosamente o SUP natin sem perturbar o pellet no fundo do tubo. Em seguida, adicione um mililitro de etanol a 75% frio a cada amostra e inverta os tubos quatro a seis vezes. Os tubos são então centrifugados novamente a 18 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius.

O sobrenatante é novamente removido e os pellets são deixados secar ao ar. Assim que os pellets estiverem secos, são dissolvidos em 50 microlitros de HCl traço quatro milimolar de pH oito e armazenados a menos 80 graus Celsius até uso posterior. Bem, acabei de mostrar como realizar imunoprecipitações de cromatina em tecido cerebral humano post-mortem congelado.

E lembre-se, ao realizar este procedimento, é importante tomar todas as precauções necessárias ao manipular tecido cerebral humano, ensaios de imunoprecipitação de cromatina podem ser usados para acrescentar uma camada adicional de compreensão da expressão gênica tanto no cérebro humano normal quanto no doente. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.