Name: Titulação de coronavírus humanos Usando um ensaio de imunoperoxidase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-28T22:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a titular coronavírus humanos usando o ensaio de imunoperoxidase, uma alternativa confiável ao método de plaqueamento para vírus sem efeito citopático. Este protocolo detalhado permite quantificar cepas como 229E e OC43 em células suscetíveis.

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O protocolo de texto completo para essa abordagem experimental está disponível em <a href="http://www.springerprotocols.com/">Protocolos Springer</a> .

Os autores não têm nada a declarar.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/751/">Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

titulação de coronavírus humanos usando um ensaio de imunoperoxidase

Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay

Cálculo de doenças infecciosas virais títulos representa uma abordagem básica e essencial experimental para virologistas. Ensaios de placa clássico não pode ser usado para vírus que não causam efeitos significativos citopático, o que é o caso de cepas 229E e OC43 de coronavírus humano (HCoV). Um ensaio de imunoperoxidase indireta alternativa (IPA) é aqui descrita para a detecção e titulação desses vírus. Células susceptíveis são inoculadas com diluições de série logarítmica de amostras em uma placa de 96 poços. Após o crescimento viral, a detecção viral por IPA produz o título de vírus infecciosos, expresso como &quot;Cultura de Tecidos Dose Infecciosa&quot; (TCID50). Isto representa a diluição de uma amostra de vírus contendo em que metade de uma série de poços de laboratório contêm vírus replicantes. Esta técnica é um método confiável para a titulação de HCoV em amostras biológicas (células, tecidos ou fluidos).

Neste vídeo, demonstramos um método alternativo para a detecção e titulação de vírus usando uma técnica de detecção de antígeno enzimático conhecido como um ensaio de imunoperoxidase. Aqui, vamos mostrar-lhe como coletar as amostras virais, preparar as células para testes, e, finalmente, o ensaio de imunoperoxidase utilizando diluições de série para determinar o título viral.

Titulação de coronavírus humanos Usando um ensaio de imunoperoxidase

A determinação de títulos virais infecciosos é uma abordagem experimental básica e essencial para virologistas. Ensaios de placa clássicos não podem ser utilizados para...

O cálculo dos títulos virais infecciosos é uma abordagem experimental básica. No entanto, o método clássico de utilização de ensaios de placa não é o mais confiável para vírus que não apresentam efeitos citopáticos, como os coronavírus humanos. Neste vídeo, demonstramos um método alternativo para detecção e titulação de um vírus, utilizando uma técnica enzimática de detecção de antígenos conhecida como ensaio de imunoperoxidase.Aqui mostraremos como coletar suas amostras virais, preparar as células para teste e, finalmente, realizar o ensaio imunoperoxidásico com diluições seriadas para determinar o título viral. Olá, meu nome é Dr. Pierre Albo, diretor do Laboratório de Neuroimunologia do Instituto AM RIP em Laval, Quebec, Canadá. Hoje demonstraremos como quantificar cepas de vírus da cor humana OT 43 e dois nove E, que são cepas protótipos desses vírus que não produzem placas em cultura.Portanto, desenvolvemos um ensaio para contornar esse problema. Esse método é chamado ensaio de imunoperoxidase. Para demonstrar este protocolo, apresento a você, meu aluno, Gabrielle Marol, meu técnico Francis Nader e minha pesquisadora colaboradora Ellan Jacob.Então vamos começar. Primeiro, queremos preparar nossas amostras de tecido. Começamos pesando previamente os tubos estéreis que usaremos para coletar cada órgão.Uma vez determinado o peso de cada tubo vazio, dissecaremos rapidamente os órgãos de interesse em condições estéreis e, em seguida, os manteremos sobre gelo. É importante lembrar de lavar os instrumentos com etanol 70% entre cada dissecação. Após coletarmos os órgãos, determinamos o peso de cada amostra biológica.Em seguida, homogeneizaremos as amostras de tecido com PBS estéril a 10% utilizando um homogeneizador de polítron em uma cabine de fluxo laminar. Ligue o homogeneizador e, em seguida, levante e abaixe o tubo para romper o tecido. Após a homogeneização de cada amostra, lave o aparelho uma vez com água estéril, uma vez com etanol a 70% e, finalmente, com PBS antes de processar a próxima amostra de tecido.Após a homogeneização das amostras, centrifugue os tubos a quatro graus Celsius por 20 minutos. A 1000 Gs, colete os sobrenadantes em novos tubos estéreis. Neste ponto, as amostras virais podem ser processadas para detecção por imunoperoxidase.Caso contrário, você pode congelá-los imediatamente a menos 80 graus Celsius e armazená-los até que esteja pronto para os ensaios. Em seguida, queremos preparar as amostras celulares. Existem diferentes métodos para preparar células aderentes e não aderentes, mas ambos envolvem a coleta dos títulos virais intracelulares e extracelulares.Para determinar a produção viral extracelular em células aderentes, coletamos sobrenadantes e tubos estéreis das células infectadas, que serão testados nos momentos apropriados após a infecção. Para estimar os títulos virais intracelulares, queremos primeiro remover o meio, lavar as células em PBS quente e estéril, e então adicionar o mesmo volume ou um volume conhecido de meio, realizando três ciclos de congelamento e descongelamento a menos 80 graus Celsius. Isso lisará as células e liberará partículas virais no meio.Para células não aderentes, primeiramente centrifugamos as células a mil G durante cinco minutos. Após a formação do pellet celular, coletamos os sobrenadantes em tubos estéreis. Isso representa a porção extracelular do vírus infeccioso.Em seguida, suspendemos o pellet celular no mesmo volume do sobrenadante coletado ou em um volume conhecido de meio de cultura. Agora realizamos três ciclos de congelamento e descongelamento a menos 80 graus Celsius para lisar as células e liberar partículas virais no meio. Isso representa a porção intracelular do vírus infeccioso.Após a lise de células aderentes ou não aderentes, centrifugue-as por cinco minutos a mil gs. Agora, o sobrenadante pode ser coletado em novos tubos estéreis e os títulos podem ser analisados com o ensaio de imunoperoxidase. Novamente, a amostra também pode ser imediatamente congelada a menos 80 graus Celsius e armazenada até a realização do ensaio.Para testar a produtividade da infecção por coronavírus humano em nossas amostras biológicas, queremos utilizar um ensaio de imunoperoxidase em células suscetíveis ao coronavírus. Primeiro, o tritamento e o tratamento são usados para criar uma suspensão de células suscetíveis a partir de uma monocamada confluente. Ao trabalhar com coronavírus humano, as células 2 29 EL 1 32 são utilizadas como células suscetíveis e, para o coronavírus humano OC 43, a linhagem celular HRT 18 é usada após a geração de uma suspensão de células suscetíveis. Elas são semeadas em uma placa de 96 poços para cultura de tecidos.Se estiver usando uma pipeta multicanal, distribua cem microlitros por poço de suspensão celular utilizando a concentração apropriada de células. O número de células suscetíveis por poço dependerá do tipo de células utilizado e do momento em que ocorrerá a inoculação das células. Após o plaqueamento, consulte nosso protocolo da Springer para obter informações mais detalhadas.Antes de iniciar o ensaio imunoperoxidásico, células suscetíveis precisam ser infectadas com as amostras que preparamos anteriormente. Quando as células suscetíveis atingirem 70 a 80% de confluência, remova o meio de cada placa de 96 poços envolvendo a placa em papel estéril e virando-a suavemente com a face para baixo sobre outra folha de papel estéril. Em seguida, adicione em cada poço cem microlitros de MEM alfa suplementado com 1% de FBS.Cada amostra deve ser testada em quatro colunas adjacentes. Na mesma placa, adicione cem microlitros por poço de alíquotas que serão testadas na primeira linha. Normalmente, células suscetíveis são inoculadas com diluições logarítmicas em série das amostras infectadas.Para fazer isso, adicione novamente 11 microlitros por poço da mesma amostra em quatro poços. Agora, na segunda linha da placa de 96 poços, misture com a pipeta multicanal pipetando para cima e para baixo três vezes e transfira 11 microlitros de cada poço para a terceira linha, e assim por diante até a última linha da placa. Após inoculados os cultivos celulares, incube as placas em câmara umidificada a 33 graus Celsius com 5%CO2 para o coronavírus humano.Células infectadas com 2290 são incubadas por cinco dias e células infectadas com coronavírus humano OC43 são incubadas por quatro. Após esse período, podemos prosseguir para a detecção do vírus.Após a incubação, estamos prontos para detectar o vírus. Primeiramente, removemos completamente o meio. Fazemos isso descartando o conteúdo das placas em toalhas de papel não estéreis dentro da cabine de fluxo laminar.Em seguida, lavamos delicadamente as células preenchendo suavemente os poços com PBS. Utilizando uma pipeta multicanal, descartamos o PBS dos poços e removemos qualquer resíduo de PBS envolvendo cada placa com papel-toalha.Após as células terem sido lavadas, você deverá fixá-las com metanol a cem por cento contendo 0,3% de peróxido de hidrogênio. Adicione a mistura de metanol às células e deixe a placa em repouso por 15 a 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação de 30 minutos, o fixador é removido sacudindo-se a placa sobre a pia. O fixador residual é removido sacudindo-a com a face voltada para baixo sobre várias toalhas de papel previamente colocadas sobre a bancada.Em seguida, deixe secar completamente ao ar, com a face voltada para cima, por aproximadamente 15 a 30 minutos, enquanto as células estão secando. Você pode preparar uma solução de anticorpo específico para o vírus na diluição apropriada em PBS. Em seguida, adicione cem microlitros do anticorpo viral específico a cada poço das placas de incubação e incube por duas horas a 37 graus Celsius.Após a incubação, remova completamente o meio descartando-o na pia. Enxágue a placa preenchendo os poços com PBS. Em seguida, descarte o conteúdo na pia e enxágue novamente com PBS.Mais duas vezes. Remova todo o PBS residual descartando-o com um movimento rápido para baixo sobre toalhas de papel não estéreis colocadas sobre a bancada. Em seguida, adicione cem microlitros a cada poço de anticorpo secundário na diluição de um para 1000.Realize uma diluição em PBS, incube a placa por duas horas a 37 graus sem CO2, 30 minutos antes do final da incubação. Prepare o reagente de detecção, que é uma mistura de DAB com PBS e 0,01% de peróxido de hidrogênio. Lave a placa três vezes em PBS, como feito anteriormente.Após a lavagem da placa, adicione cem microlitros do reagente de desenvolvimento a cada poço. Incube de 10 a 20 minutos em temperatura ambiente ou até que o controle positivo esteja corado. Para interromper a reação, lave a placa uma vez com água como feito anteriormente com PBS e preencha cada poço com cem microlitros de água desionizada.Finalmente, leia as placas com o microscópio óptico para quantificar todos os poços que apresentam células coradas. Agora, finalmente, podemos determinar o título do nosso vírus. Isso pode ser calculado usando o método car, cuja equação pode ser encontrada no protocolo Springer que acompanha este vídeo.Acabamos de mostrar como titular coronavírus humanos ao realizar este procedimento. É importante lembrar que você está trabalhando com amostras contendo ambos os vírus e que precisa atuar em condições estéreis. Assim sendo, é isso.Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

titration-of-human-coronaviruses-using-an-immunoperoxidase-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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