Name: De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-10T15:33:00.000+00:00
Duration: 3 min 50 s
Description: Aprenda a manter e fazer passagem de células-tronco embrionárias humanas em condições livres de células alimentadoras usando Matrigel. Confirme a pluripotência por imunofluorescência.

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Humana estudos de células-tronco embrionárias no laboratório Teitell são suportados por um Instituto da Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM), as sementes conceder RS1-00313. Agradecemos a membros do Centro de Medicina Regenerativa Broad e Investigação em Células Estaminais na Universidade da Califórnia, especialmente Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, e membros do Instituto Broad Stem UCLA Facility núcleo celular para o seu apoio de nossos estudos.

HESCs divisão de Matrigel para Matrigel Normalmente, uma placa de 6 bem-confluentes de hESCs em Matrigel pode ser dividida 01:03 - 01:05 para outra placa Matrigel, com os poços se tornar confluentes novamente 4-5 dias após a divisão. <ol><li> CM e placas Matrigel estão preparados como descrito acima antes de se separarem. </li><li> No dia da separação, lavar cada cavidade para dividir com 1 × PBS, pH7.4, adicionar 1 ml de 1mg/ml Dispase (solução diluída de ações 5mg/ml com DMEM/F12 media) a cada poço e incube a 37 ° C por 3 min. </li><li> Lavar cada cavidade três vezes com 1 × PBS, pH7.4, adicionar 1 ml de ES mídia sem bFGF, use um raspador de células para raspar as colônias fora do fundo do poço, recolher o hESCs suspensas em um tubo falcon 50ml, e pellet por centrifugação a 200g por 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Para re-placa do hESCs em placas Matrigel, primeiro lavar as placas com Matrigel DMEM/F12 e adicionar 2,5 ml de CM suplementado com 10ng/ml bFGF por poço. Ressuspender o sedimento em CTEh um volume adequado de CM suplementado com 10ng/ml bFGF, pipetar a suspensão célula para cima e para baixo três vezes. (NOTA: Quando hESCs para dividir vêm de placas Matrigel, as touceiras são muito fáceis de quebrar, por isso três rodadas de pipetagem é suficiente e mais de pipetagem pode perturbar o over-colônias e fazer uma única célula.) Alíquota 0,5 ml de suspensão CTEh aglomerados por poço da placa Matrigel 6-bem para conseguir 3ml por poço como um volume final. Coloque a placa em um 37 ° C incubadora. </li></ol> Detecção de marcadores pluripotência por microscopia de imunofluorescência Microscopia de imunofluorescência é usado para examinar a expressão de marcadores de pluripotência CTEh Oct-4 e SSEA-4 durante o cultivo. <ol><li> Aspirar media de um bem e lave com 1 × PBS, pH 7.4. Adicionar 2 ml de formaldeído 3,7% para o bem de correção para 10 min. </li><li> Enxágüe com 1xPBS, pH 7,4, adicionar 2 ml de metanol para o bem e coloque a -20 ° C por 2 min. </li><li> Enxágüe com 1xPBS, pH 7,4, e bloquear com 1ml de 0,2% serume albumina bovina (BSA) por 5 min. </li><li> Adicionar 1 ml de Oct-4 ou anti-h/mSSEA-4 anticorpos (diluição de 1:200 em 0,2% BSA), e incubar em temperatura ambiente por 1 hora ou a 4 ° C durante a noite. (NOTA: para SSEA-4 coloração, vá diretamente para a etapa 6) </li><li> Enxaguar três vezes com 1xPBS, pH 7,4, acrescentar FITC-conjugado IgG de coelho (1:500 diluição em 0,2% BSA), e incubar em temperatura ambiente por 1 hora. </li><li> Lave 3 vezes com 1xPBS, pH 7,4, e colocar uma gota de solução de montagem (pode conter DAPI se visualização nuclear é desejado) no centro do poço. Coloque lamela em cima das células, selo com unha polonês, e avaliar por microscopia de imunofluorescência. </li></ol> Humana recibos células-tronco embrionárias ES mídia (media células-tronco embrionárias): DMEM/F12 - 400ml Knockout Serum Replacer - 100ml Não-essenciais Aminoácidos - 5ml 200mM Solução Glutamax / BME - 5ml Penicilina / estreptomicina - 5ml Misture bem e guarde Meios de Cultura finais CTEh em garrafas de 500ml a 4 ° C. Bom para um máximo de duas semanas. Cultura MEF Media: DMEM - 1000ml FBS - 100ml Não-essenciais Aminoácidos - 10ml Glutamina - 10ml Penicllin Estreptomicina / - 10ml Misture bem e guarde Meios de Cultura finais MEF a 4 ° C. Solução Glutamax / BME 200mM: Glutamax - 100ml β-mercaptoetanol (solução stock de 14,3) - 140 μ1 Misture duas soluções bem e, em seguida, porções de 10ml alíquota. Manter alíquotas a -20 ° C. bFGF Solution (concentração final de estoque: 10 microgramas / ml): bFGF (FGF2) - 50 mg BSA 0,1% em 1xPBS, pH 7,4 - 5ml Dissolver 50 microgramas bFGF em BSA 0,1% 5ml para fazer um estoque mcg / ml 10. Alíquota em porções de 500 mL. Armazenar a -80 ° C. Colagenase IV Solução (1mg/ml): Colagenase IV - 50mg DMEM/F12 Media - 50ml Adicione o colagenase IV pó para um tubo falcon 50ml. Na capa, mix em 50ml de estéril DMEM/F12 mídia. Solução para o Vortex &lt;1 min. para se certificar de que o pó esteja dissolvido. No capô, passam por um filtro de 0,22 mM em um novo tubo estéril falcon 50ml. Esta solução é boa para um máximo de duas semanas armazenadas a 4 ° C. Dispase Solution (1mg/ml): Dispase 5mg/ml - 2ml Mídia DMEM/F12 - 8ml Alíquota de solução de 5mg/ml Dispase comerciais e armazenar a -20 ° C. Diluir dispase a 1mg/ml usando DMEM/F12. Esta solução pode ser mantida por uma semana a 4 ° C.

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts+%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+Nature+Biotechnology+19%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)"> Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Esta série de três vídeos demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em fibroblastos de rato células embrionárias (MEF) alimentador (vídeo 1), como passagem para os Matrigel livre de células alimentador de placas (vídeo 2), e como manter a hESCs por passaging em Matrigel alimentação livre de células condições (vídeo 3). Numerosos estudos anteriores mostraram que a manutenção de viabilidade, hESCs indiferenciado requer a cultura em células alimentadoras inativado MEF. No entanto, para muitas experiências, uma popu...

<table><tbody><tr><td>Substituto de Soro para Depleção (KSR)</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>SFB</td><td>Reagente</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagente</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase IV</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagente</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina / Estreptomicina </td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Oct-4</td><td>Reagente</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>Anti-h/mSSEA-4 conjugado com Fico&amp;#8211;eritrina, IgG3 de camundongo</td><td>Reagente</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secundário IgG de coelho conjugado com FITC</td><td>Reagente</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

de mefs para matrigel 3: hescs passaging de matrigel em matrigel

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada.

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 3 de 3.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em condições livres de células alimentadoras e como realizar a passagem contínua...

Para dividir células-tronco embrionárias humanas cultivadas em Matrigel, utilizamos dois matrigel. Começamos com uma placa de seis poços confluentes de células-tronco embrionárias em matrigel, que podem ser divididas de um para três, ou de um para cinco, em outra placa de matrigel. Isso permite que os poços fiquem novamente confluentes em quatro a cinco dias após a divisão, no próprio dia da divisão.Lave cada poço que será dividido com um XPBS pH 7,4. Em seguida, adicione um mililitro de uma solução de um miligrama por mililitro, dis paste, a cada poço e incube a 37 graus Celsius por três minutos. Lave cada poço três vezes com um XPBS pH 7,4.Em seguida, adicione um mililitro de meio para células-tronco embrionárias sem BF GF e use um espátula celular para desprender as colônias do fundo do poço. Colete as células-tronco embrionárias em suspensão em um tubo Falcon de 15 mililitros e forme o pellet por centrifugação a 200 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente. Para repicar as células-tronco embrionárias humanas em placas de Matrigel, primeiro lave as placas de Matrigel com D-M-E-M-F 12 e adicione 2,5 mililitros de meio condicionado com metilação suplementado com 10 nanogramas por mililitro.FGFB por poço após as células terem sido centrifugadas novamente, suspenda o pellet de células-tronco auriculares humanas em um volume apropriado de condição de metila. Adicione ao meio 10 nanogramas por mililitro de FGFB e pipete a suspensão celular para cima e para baixo três vezes.Leve em consideração que os agregados de células-tronco do matrigel se dissociam facilmente. Portanto, pipetar três vezes deve ser suficiente para romper os agregados, sem deixar as colônias muito pequenas. Por fim, alíquotas de 0,5 mililitros da suspensão de células-tronco humanas por poço, para obter três milhões por poço.Como volume final, certifique-se de que os aglomerados celulares estejam uniformemente dispersos e, em seguida, coloque a placa em um incubador a 37 graus. Dependendo da linhagem específica de células-tronco amry, as células-tronco amry tornar-se-ão novamente confluentes em quatro a cinco dias após a divisão. Quando as colônias começarem a tocar umas nas outras, é importante saber se suas células-tronco amry humanas mantêm a pluripotência ou a condição de tronco em cultura.Para verificar a pluripotência das células durante o cultivo de células-tronco embrionárias, utilizamos microscopia de imunofluorescência para examinar a expressão dos marcadores de pluripotência, OCT4 e SSEA-4, em um dos poços. Nossa placa de seis poços é fixada e corada para OCT4 e SSEA-4. Se observarmos que as células estão marcadas fluorescentemente para ambos esses marcadores, saberemos que nossas células-tronco embrionárias humanas mantiveram a pluripotência e podem ser utilizadas em nossos experimentos.Acabamos de mostrar como cultivar e manter células-tronco embrionárias humanas potentes, juntamente com fibroblastos embrionários, células alimentadoras e em condições livres de campo magnético em metro job. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

from-mefs-to-matrigel-3-passaging-hescs-from-matrigel-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo mostramos como nosso laboratório rotineiramente passagens MATIZ linhas de células-tronco embrionárias com tripsina.

MATIZ Passaging-tronco embrionárias humanas Cell-linhas com Tripsina

Este vídeo demonstra como crescer células estaminais embrionárias humanas (hESCs) em células embrionárias de rato de fibroblastos (MEF) alimentador. Parte 1 de 3.

De MEFs para Matrigel I: hESCs Passaging na Presença de MEFs

Este vídeo demonstra como manter o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) no alimentador livre de células condições e como hESCs contínua passagem de alimentação livre de células condições. Confirmação de CTEh pluripotência cultivadas em alimentador livre de células ao microscópio de imunofluorescência condições também é demonstrada. Parte 2 de 3.

De MEFs para Matrigel 2: hESCs Divisão de MEFs para Matrigel

Diferenciação dirigida de hESCs em células específicas tem gerado muito interesse na medicina regenerativa. Nós fornecemos uma concisa, protocolo passo a passo para determinar...

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.

Preparação de células embrionárias de camundongos Fibroblastos adequados para a cultura de células-tronco embrionárias humanas e pluripotentes induzidas

Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.

A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias

Aqui, nós descrevemos um protocolo baseado em reprogramação epigenética de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) para a geração de uma população homogênea de células progenitoras musculares esqueléticas que, sob condições de cultura permissiva formam aglomerados tridimensionais de miofibras contráteis (myospheres), que recapitulam características biológicas do ser humano músculos esqueléticos.

Geração de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramação

Nós, com base no conhecimento da biologia do desenvolvimento e pesquisas publicadas, desenvolvemos um protocolo otimizado para gerar com eficiência neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo A9 a partir de células-tronco embrionárias humanas e células-tronco pluripotentes induzidas humanas, o que seria útil para modelagem de doenças e terapia de substituição celular para a doença de Parkinson.

Dirigido neurônios dopaminérgicos Diferenciação de Células-Tronco pluripotentes humanas

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar eficientemente células trofoblásticas humanas a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando proteína morfogênica óssea 4 e inibidores das vias Activina/Nodal. Este método é adequado para a diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas e pode gerar grandes quantidades de células para manipulação genética.

Na diferenciação in vitro de pluripotentes humanas Células-tronco em células Trofoblásticas

Para evitar as limitações associadas à passagem enzimática ou mecânica de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC ou hiPSC mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA.

Passagem rápida, econômica e livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas em células alimentadoras por adesão mediada pelo ácido etilenodiaminotetracético

Aprenda a manter e fazer passagem de células-tronco embrionárias humanas em condições livres de células alimentadoras usando Matrigel. Confirme a pluripotência por imunofluorescência.

De MEFs para Matrigel 3: hESCs Passaging de Matrigel em Matrigel

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