As células de memória efetoras T imagem no ouvido após a indução de DTH Adoptive
14 de agosto de 2008
Aqui demonstramos um método para induzir e gravar o progresso de um atraso de hipersensibilidade do tipo-reação (DTH) na orelha de ratos. Isso é seguido por uma demonstração da preparação do tecido da orelha de rato para geração de imagens de dois fótons da resposta das células de memória / T efectoras.
Olá, sou Melanie Matthew. Sou aluna de pós-graduação no laboratório de Micah Hollins, na Universidade da Califórnia, Irvine, no Departamento de Fisiologia e Biofísica. E hoje, juntamente com a Dra. Christine Beaton, vamos mostrar como realizamos a imagem da população de linfócitos T de memória ou com resposta efetora na orelha do rato.
A Dra. Christine Beaton induzirá primeiro hipersensibilidade tardia DTH na orelha de rato. Em seguida, passaremos à imagem in situ da orelha de rato por duas microscopias fotônicas. Há dois dias, injetei células T específicas para albumina marcadas com GFP em um Lewis hiper.
E hoje vou desafiar o mesmo rato na orelha. Então, na orelha direita, vou injetar albumina. E na orelha esquerda, vou apenas injetar um pouco de PBS.
A dose de albúmina que estou injetando é de 20 microgramas em 20 microlitros. E a albúmina que estou utilizando é uma mistura, na proporção de um para um, de albúmina marcada com Texas Red e albúmina não marcada. Então, este é o animal ao qual vou mostrar como farei a injeção.
Então, tenho minha mão esquerda, sou destro. Com a mão esquerda, tirei a luva para poder colocar um dedo abaixo da orelha e o outro acima, esticando a pele para que eu possa ver exatamente onde estou com a agulha e introduzi-la entre as duas camadas da pele, no espaço aéreo, que é muito fino. Para isso, uso agulhas de calibre 27, para ter algo extremamente fino que possa penetrar ali.
Então, se eu virar, você certamente verá onde foi aplicado o Texas red e onde foi aplicado o PBS. Estamos agora 42 horas após o desafio e vou usar um micrômetro com mola para medir a espessura da orelha. Vou medir ambas as orelhas, a orelha direita que foi desafiada com a albumina e a orelha esquerda que não foi desafiada, e a diferença na espessura dará uma ideia da intensidade da inflamação.
Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 ou 58 ou 57 ou 57. E o outro ouvido 4 49 4 55 4 48.4 47 4 46, 4 50. Olá. Então, Christine Beaton acaba de nos entregar a rata que ela removeu após a medição da resposta de HST.
Nós os transportamos até aqui sobre gelo. Esta é a orelha esquerda da rata. E agora estamos no laboratório de Ian Parker realizando microscopia de dois fótons.
Então, vou preparar estas orelhas para a imagem de dois fótons in situ. Vou preparar uma das orelhas do rato aqui na base da orelha. O tecido é bem mais espesso e temos alguns pelos eriçados que vão ficar um pouco desorganizados se eu simplesmente começar a cortar nele.
Então, a primeira coisa que vou fazer é cortar um pouco desse cabelo. Estou segurando a orelha suavemente. Meu dedo facilita muito o controle do tecido quando você o segura entre o polegar e o indicador.
Eu prefiro usar os dedos a usar pinças porque, com as pinças, eu simplesmente não consigo sentir tão bem o que o tecido está fazendo, e sempre estamos preocupados em danificar o tecido. Por isso, queremos conseguir sentir o que estamos fazendo com ele. É por isso que gosto de usar meus dedos.
Esta é a camada dérmica se destacando aqui da orelha do rato. Então, enquanto eu estava removendo alguns pelos, consegui delicadamente cortar parte dessa derme, que simplesmente se solta. Há algumas tesouras de dissecação bem pequenas para isso, apenas algumas tesouras levemente curvas.
Você não quer furar o tecido e pode avançar suavemente desde a base da orelha até o topo, cortando delicadamente algumas camadas dérmicas. Portanto, não precisamos de uma janela muito grande para a imagem. Esta área bem aqui será suficiente para obter algumas imagens boas das células que estão infiltrando o tecido.
Como você pode ver, ainda temos alguns vasos sanguíneos intactos aqui na base da orelha e praticamente ao longo de todo o caminho até a ponta. Toda essa área será muito boa para a imagem do DTH. Então, vou prosseguir e cortar esse pedaço de tecido que expus, para obter um pequeno fragmento de tecido que podemos colar na nossa platina de imagem.
Então, faça um corte aqui, vire-o. Posso cortar aqui. Temos um pequeno pedaço de tecido que podemos preparar em nosso microscópio de dois fótons para imageamento.
Essas são lamínulas plásticas inquebráveis que cortamos no tamanho do nosso tecido. Em seguida, montamos o tecido sobre elas usando o bet bond. Depois, fixamos essas lamínulas plásticas inquebráveis com graxa de silicone em nossa platina de imagem in situ.
Vou pegar este pequeno pedaço de tecido aéreo, que tem uma leve curvatura, então precisarei aplainá-lo ao colá-lo. Não é ideal, mas funcionará. Então, basta pegar uma dessas lamínulas e cortá-la, estimando o tamanho da sua orelha, e cortar um pouco maior do que você imagina que será necessário.
Para montar nosso tecido sobre a lamínula, utilizamos um supercola seguro para tecidos chamado bet long. Obtemos esse produto da 3M e colocamos apenas algumas gotas sobre a lamínula.
Não quero ter muito. E você também precisa garantir que esteja distribuído uniformemente. Então, vou pegar um pequeno pedaço de papel de lente e usar o canto dele para espalhar a cola sobre a lamínula aqui.
Vou colocar um pouco mais de cola extra, e assim que essa cola tocar na água, ela vai endurecer. Portanto, você deve ter muito cuidado com sua amostra de tecido. Então, vou pegar o canto do tecido aqui, que provavelmente não vamos imaginar porque está na parte curva.
Vou secar um pouco. A parte inferior, apenas no papel de lente, para que fique completamente seca. E vou tocar com o canto, este tecido da orelha de rato, na lamínula.
E ele deve curar imediatamente onde eu o toquei. O restante, vou apenas aplainar um pouco, pressionando suavemente as bordas. Assim, esperamos obter um bom quadro de imagem.
Agora, vou proceder com a cura da cola mergulhando-a no meio. Para evitar que a cola adira à parte superior do tecido, viramos o tecido com a face voltada para baixo e o mergulhamos lentamente, primeiro com um canto, no nosso reservatório de meio; assim, ele deve aderir bem, permitindo a obtenção de imagens na câmara de imagem em tecido. Agora, vamos montar o fragmento de tecido que preparamos para imagem in situ, o pedaço de tecido de cerveja, sobre a platina.
Aqui está nosso fragmento de tecido com a graxa de silicone na parte inferior, e nós simplesmente o colocamos suavemente no fluxo do meio. Agora ele está preso ao fundo da platina pela graxa de silicone. Aumente o fluxo do meio com nosso sensor de temperatura bem ao lado dele.
E agora vamos nos concentrar. Então, vou ligar o nosso foco, nova luz, nosso brilho intenso. Vou pegar nosso objetivo de 20 x e abaixá-lo até a câmara.
Certifique-se de que não toque no tecido. Olhe através da ocular e foque no nosso tecido auricular. E é isso.
Aqui você observa folículos pilosos verdes autofluorescentes na camada dérmica da orelha do rato. Ao redor desses folículos pilosos há uma camada densa de colágeno. Esta é uma camada que removemos para a imagem de fótons T das células de memória T efetoras.
Os folículos pilosos autofluorescentes irão obscurecer a imagem, assim como o colágeno brilhante da camada dérmica superior. Ok, então aqui você pode observar que temos APCs que incorporaram volina conjugada com vermelho Texas, e elas estão acomodadas ao longo dessas fibras de colágeno azuis. As fibras de colágeno são azuis devido à geração de segundo harmônico que obtemos na imagem de fótons ao longo das fibras de colágeno.
Temos linfócitos T altamente móveis. Eles se deslocam para cima e para baixo nas fibras de colágeno e interagem com as APCs. Neste vídeo, você viu a Dra. Christine Beaton induzir DTH adotivo na rata Lewis.
Em seguida, mostramos a preparação da orelha para imagem, as células de memória T efetoras responsivas, a orelha do rato e nossas técnicas de dois fótons para realizá-la.
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Visão Geral
Este artigo demonstra um método para induzir e registrar reações de hipersensibilidade do tipo tardio (DTH) na orelha de rato, seguido pela preparação do tecido da orelha de rato para a imagem de dois fótons das respostas de células T.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Imunologia
- Neurociência
- Biofísica
Contexto
- A hipersensibilidade do tipo tardio (DTH) é uma resposta imune fundamental.
- O entendimento da dinâmica dos linfócitos T é essencial para a pesquisa imunológica.
- A microscopia de dois fótons permite a imagem in situ das respostas celulares.
- Modelos com ratos são frequentemente utilizados para estudar respostas imunes.
Objetivo do Estudo
- Induzir e registrar reações de hipersensibilidade tardia nas orelhas de ratos.
- Visualizar populações de linfócitos T efetores e de memória.
- Aprimorar a compreensão do comportamento dos linfócitos T in vivo.
Métodos Utilizados
- Indução de DTH no tecido da orelha de rato.
- Injeção de linfócitos T marcados com GFP.
- Microscopia de dois fótons para obtenção de imagens.
- Análise in situ das respostas dos linfócitos T.
Resultados Principais
- Indução bem-sucedida de DTH no modelo de orelha de rato.
- Visualização de populações de linfócitos T utilizando microscopia de dois fótons.
- Informações sobre a dinâmica das respostas imunes in vivo.
- O método demonstrado pode ser aplicado a estudos imunológicos adicionais.
Conclusões
- O método fornece uma abordagem confiável para estudar reações de hipersensibilidade tardia.
- A microscopia de dois fótons é eficaz para observar o comportamento de células T.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão das respostas imunes.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização direta da dinâmica das células T de memória efetora em uma resposta imune específica de tecido, apoiando a desmistificação mecanicista na validação de alvos em imunologia. Ao combinar a indução adotiva de DTH com imagem de dois fótons, fornece dados quantitativos com resolução espacial sobre a motilidade das células T e as interações com células apresentadoras de antígeno. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, vinculando o comportamento celular a desfechos imunes funcionais em um sistema relevante para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas por meio da visualização in vivo do recrutamento e ativação de linfócitos T efetores/memória CCR7-.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos imunomoduladores mediante observação direta das interações entre linfócitos T e APCs.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao correlacionar padrões de motilidade de linfócitos T com a intensidade inflamatória em um sistema relevante para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara explantes de tecido padronizados para obtenção de imagens consistentes e reproduzíveis da dinâmica das células imunes.
- Valor Operacional: Estabelece uma plataforma para leituras quantitativas, como rastreamento celular, frequência de interações e profundidade de infiltração.
- Escalabilidade: Utiliza tecido auricular minimamente processado, compatível com fluxos de trabalho de imagem de alta resolução.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância imunológica ao preservar a arquitetura nativa do tecido e as interações entre células durante a aquisição de imagens.
- Valor Operacional: Conecta a descoberta e a validação pré-clínica ao permitir o acompanhamento longitudinal das respostas imunes no mesmo modelo.
- Mitigação de Riscos: Reduz a ambiguidade mecanicista na identificação de compostos promissores ao fornecer evidência direta do engajamento do alvo no tecido.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a validação pré-clínica, permitindo o aprimoramento iterativo de candidatos imunomoduladores com base no comportamento em tempo real das células imunes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da visualização das respostas de linfócitos T ao desafio com antígeno em um modelo controlado de reação de hipersensibilidade tardia (DTH).
- Triagem: Fornece preparações de tecido prontas para ensaio, com espessura e montagem padronizadas, para obtenção de imagens por dois fótons reprodutíveis.
- Análise: Gera dados quantitativos, incluindo velocidade celular, comprimento de trajetória e distribuição espacial em relação ao colágeno e às células apresentadoras de antígenos (APCs).
- Pesquisa Translacional: Garante continuidade da descoberta à pré-clínica, utilizando o mesmo modelo de rato tanto para indução quanto para imagem.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável, aplicável a múltiplos alvos de imunologia e linhagens de linfócitos T específicas para antígenos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece desvio de risco mecanicista por meio da visualização direta da função de células T de memória efetora no tecido.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo do tecido e as condições de imagem para melhorar a reprodutibilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao associar a dinâmica das células T a desfechos inflamatórios em um modelo preditivo.
- Impacto no Portfólio: Permite o avanço com ajuste de risco ao validar os efeitos do alvo sobre o comportamento das células imunes antes de estudos in vivo onerosos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em transferência adotiva de linfócitos T, indução de reação de hipersensibilidade tardia (DTH) e microscopia de dois fótons.
- Depende do acesso a microscópios de dois fótons com capacidade de geração de segundo harmônico para visualização de colágeno.
- Necessita de protocolos padronizados de manipulação de tecidos para garantir montagem consistente e viabilidade durante a aquisição de imagens.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método de preparo da orelha a outros tipos de tecidos ou modelos de doenças.
- É limitado pela necessidade de linhagens de linfócitos T específicas para o antígeno e controles apropriados para distinguir inflamação específica de inflamação inespecífica.
