Name: As células de memória efetoras T imagem no ouvido após a indução de DTH Adoptive (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Aprenda a induzir e registrar reações de hipersensibilidade do tipo tardio na orelha de ratos usando microscopia de dois fótons. Este método permite visualizar células T efetoras e de memória in situ.

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Indução de DTH Adoptive Por favor, veja o artigo jove: <a href="/index/Details.stp?ID=325">Indução e Monitorização de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos</a> Christine Beeton, George K. Chandy Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia, Irvine Experimentos J. visualizado, Edição 8 Aqui, temos modificado esse protocolo usando antígeno (ovalbumina) conjugado com Texas Red-na proporção de 1:1 com antígeno não marcado para permitir a visualização de fagocíticas células apresentadoras de antígenos. Colheita de tecido da orelha <ol><li> Euthanize o rato no tempo desejado ponto por procedimentos descritos no seu protocolo de animais aprovados. Aqui, usamos uma overdose do anestésico, isoflurano. Isto é feito em um recipiente fechado localizado dentro de uma capa bem ventilado. Certifique-se o animal está morto por uma decapitação de por a abertura da cavidade torácica e corte o coração. </li><li> Com uma tesoura grande remover a orelha com um único corte, o mais próximo possível do corpo do animal quanto possível (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_0/Figure_1.jpg" alt="Figure_1.jpg"> Figura 1. Remoção da orelha de rato </li><li> Coloque o ouvido em um tubo cônico contendo 15 ml ~ 10 ml de gelado 1x PBS ou RPMI-1640. Mantenha as amostras de tecido no gelo até que esteja pronto para preparar o tecido para a imagem latente. </li><li> Tecido a imagem o mais rapidamente possível; encontramos, porém, que 1 a 2 horas sobre o gelo não tem nenhum efeito perceptível sobre a motilidade celular no tecido quando comparado ao tecido colhidas e gravadas imediatamente. </li></ol> Preparação do tecido for Imaging I. A remoção da camada epidérmica e dérmica * Nota: A camada profunda da derme deve ser mantida intacta. Se feito corretamente grandes vasos sanguíneos permanecerá intacta ea cartilagem da orelha não será exposto. Esta é uma técnica difícil, especialmente quando não há inflamação (condições de controle) e é útil usar um microscópio de dissecação. <ol><li> Coloque as duas tecido e meios de comunicação a partir do tubo cônico de 10 centímetros placa de cultura de tecidos. </li><li> Com as mãos enluvadas segurar a orelha de rato delicadamente na ponta da orelha (distal) com o lado dorsal da orelha para cima (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_1/Figure_2.jpg" alt="Figure_2.jpg"> Figura 2. Fur aparar a orelha </li><li> Com o polegar na parte superior da orelha, o tecido firme, enquanto com a ponta de fechado Dumont # 5 tesoura para separar a derme da derme profunda. Alternativamente, se a ponta da orelha tem um excesso de pele / derme profunda, isso pode ser apreendido com uma pinça e gentilmente puxou para separar este a partir do tecido por baixo (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_2/Figure_3.jpg" alt="Figure_3.jpg"> Figura 3. Remoção da derme superior </li><li> Uma vez que uma pequena área da pele foi separado do tecido subjacente, repita as etapas de separação como alternativa usar a tesoura para cortar entre as camadas dérmicas e pinças para remover suavemente e retire a pele desalojado. </li><li> Expor um 5 x 5 mm ou maior área de tecido da orelha que é pelo menos 3 mm a partir do site inicial da injeção de antígeno (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_3/Figure_4.jpg" alt="Figure_4.jpg"> Figura 4. Tecido exposto para imagens </li></ol> II. Protegendo Tissue ao Palco Imagem <ol><li> Cortar uma lamínula de plástico para um tamanho ligeiramente maior do que o tecido preparado. </li><li> Espalhe uma fina camada de cola 3M ™ Vetbond tecido-safe em todo o slide. </li><li> Segure o canto do tecido preparado (onde não são susceptíveis de imagem), remova a mídia, e bata na parte de baixo do tecido em papel lente ou Kym pano para remover o excesso de mídia. </li><li> Tocar a borda do tecido para o slide cola cobertas (as curas Vetbond imediatamente sobre o tecido molhado). Esticar suavemente o tecido plano, com a extremidade oposta sendo o último a tocar o slide (Figura 5) <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_4/Figure_5.jpg" alt="Figure_5.jpg"> Figura 5. Montagem de tecido para cobrir slip </li><li> Curar a ™ Vetbond invertendo o tecido da amostra / slide e mergulhando-o em um reservatório de meios tais que o tecido e deslize estão viradas para baixo e aproximadamente em um ângulo de 45 graus. Segurando o tecido de cabeça para baixo em um ângulo ajuda a evitar excesso de cola de cura na superfície dos tecidos expostos. Cola na superfície do tecido irá bloquear a laser (Figura 6). <img src="/files/ftp_upload/old/907_2008_8_13_5/Figure_6.jpg" alt="Figure_6.jpg"> Figura 6. Cura de tecidos vetbond glue por imersão em meios Nota: 05/02 passos podem levar um pouco de prática para dominar. Tente praticar com pedaços de tecidos descartados ou extra antes de tentar, pela primeira vez. </li><li> Dab uma pequena quantidade de graxa de silicone na parte inferior do slide. </li><li> Coloque o slide na câmara de perfusão. Certifique-se que a mídia perfusão está fluindo, 37 ° C e oxigenado antes de adicionar o tecido. Pressione gentilmente as bordas do slide fazendo um selo com a graxa de silicone entre o fundo da câmara de perfusão ea lamínula de plástico. </li></ol> III. Dois Photon Imagens <ol><li> Utilizando-campo brilhante luz transmitida, o foco em cima do tecido. Desligar todas as luzes. </li><li> Ligue o laser, PMTs conforme exigido pelo seu sistema de microscópio multi-fotão. </li><li> Geração de segundo harmônico (SHG) em proteínas altamente ordenada fibroso (colágeno e miosina) produz um sinal de menos metade do comprimento de onda do laser de excitação. Nós usamos excitação em 900 nm, levando a SHG a 450 nm que pode ser visualizado através do canal de "blue" do microscópio. SHG geração é um processo não-linear (dois fótons), e, portanto, fornece uma óptica "corte" efeito semelhante ao de excitação de dois fótons de fluorescência. O pico de eficiência de SHG ocorre quando as fibras são perpendiculares ao laser, enquanto fibrilas que são executados em paralelo não será visualizado 1. </li><li> Localizar uma área de imagem boa com abundância de células, definir a sua área de aquisição de tal forma que a maioria das células estão no centro e comece a imagem. Nota: Nas reações DTH, as células T e outros infiltrados celulares são encontrados frequentemente para ser concentrados juntos enquanto outras áreas são desprovidas de se infiltrar em células 2. Portanto, pode demorar algum tempo à procura do tecido para encontrar a melhor área para a imagem. </li><li> Verificar a viabilidade celular através da avaliação da velocidade de células e polaridade durante o exame. Use o poder menor laser que proporciona uma qualidade de imagem aceitável para garantir o mínimo de fotografias danos. </li><li> Troca em uma preparação de novos tecidos, conforme necessário. </li></ol>

<ol><li>Koo, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+the+voltage-gated+potassium+channel+Kv1.3+inhibits+immune+responses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo.</a> J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).</li>
<li>Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophil+activation+and+T+lymphocyte+infiltration+in+allergen-induced+late+phase+skin+reactions+and+classical+delayed-type+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity.</a> J Immunol. 147, 816-822 (1991).</li>
<li>Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoaggressive+effector+T+cells+in+the+course+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+visualized+in+the+light+of+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy.</a> J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).</li>
<li>Kawakami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+effector+cell+trafficking+and+autoantigen+recognition+within+the+unfolding+autoimmune+encephalomyelitis+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion.</a> J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Imaging+of+Effector%2FMemory+T+Cells+During+DTH+and+Suppression+by+Kv1.3+Channel+Block%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block.</a> Immunity. , In Press (2008).</li>
</ol>

as células de memória efetoras t imagem no ouvido após a indução de dth adoptive

Imaging Effector Memory T cells in the Ear After Induction of Adoptive DTH

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação imunológica em que os jogadores principais são CCR7 - efetoras / linfócitos T de memória. Aqui, nós demonstramos um método para induzir e gravar o progresso de uma reação de DTH no ouvido do rato. Isso é seguido por uma demonstração da preparação do tecido da orelha de rato para geração de imagens de dois fótons do CCR7 - resposta das células de memória / efetoras T. Um DTH adotiva é induzida pela injeção intraperitoneal de GFP-rotulados Ova específicos CCR7 - linha de célula de memória / efetoras T (Beeton, C J. Experiências visualizado, Issue 8). Células são então permaneceram em ratos por 48 horas antes do desafio, injetando uma orelha com uma solução salina (controle de ouvido) ea outra com uma mistura 1:1 de conjugados óvulos e Ova de Texas-Vermelha (Ova-TR) para permitir a visualização residente de células apresentadoras de antígenos. Nós descrevemos um método de preparação dos tecidos útil para geração de imagens a motilidade das células na camada profunda da derme durante uma resposta imune, em conjunto com a visualização das fibras colágenas por geração de segundo harmônico. Tecido da orelha é cortada em 5 x 5 quadrados mm (um pouco maior é melhor) e montados em lamínulas de plástico usando Vetbond ™, que são protegidos usando graxa de silicone em uma câmara de imagem e superfused por oxigênio bolhas meio de cultura de tecidos a 37 ° C .

Aqui demonstramos um método para induzir e gravar o progresso de um atraso de hipersensibilidade do tipo-reação (DTH) na orelha de ratos. Isso é seguido por uma demonstração da preparação do tecido da orelha de rato para geração de imagens de dois fótons da resposta das células de memória / T efectoras.

As células de memória efetoras T imagem no ouvido após a indução de DTH Adoptive

A hipersensibilidade tardia (HT) é uma reação imunitária na qual os principais agentes são os linfócitos T efetores/de memória CCR7+. Aqui, demonstramos um...

Olá, sou Melanie Matthew. Sou aluna de pós-graduação no laboratório de Micah Hollins, na Universidade da Califórnia, Irvine, no Departamento de Fisiologia e Biofísica. E hoje, juntamente com a Dra. Christine Beaton, vamos mostrar como realizamos a imagem da população de linfócitos T de memória ou com resposta efetora na orelha do rato.A Dra. Christine Beaton induzirá primeiro hipersensibilidade tardia DTH na orelha de rato. Em seguida, passaremos à imagem in situ da orelha de rato por duas microscopias fotônicas. Há dois dias, injetei células T específicas para albumina marcadas com GFP em um Lewis hiper.E hoje vou desafiar o mesmo rato na orelha. Então, na orelha direita, vou injetar albumina. E na orelha esquerda, vou apenas injetar um pouco de PBS.A dose de albúmina que estou injetando é de 20 microgramas em 20 microlitros. E a albúmina que estou utilizando é uma mistura, na proporção de um para um, de albúmina marcada com Texas Red e albúmina não marcada. Então, este é o animal ao qual vou mostrar como farei a injeção.Então, tenho minha mão esquerda, sou destro. Com a mão esquerda, tirei a luva para poder colocar um dedo abaixo da orelha e o outro acima, esticando a pele para q

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7 efetuador linfócitos T de memória. Aqui demonstramos como induzir DTH ativa em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Indução e Monitoramento de hipersensibilidade do tipo retardada Ativa (DTH) em ratos

De hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é uma reação inflamatória mediada por CCR7-efetoras de memória T (TEM) linfócitos. Aqui demonstramos como ativar células antígeno-específicas TEM, induzir DTH adotivos em ratos Lewis e monitorar a resposta inflamatória.

Indução e Monitoramento de hipersensibilidade tardia-Type Adoptive em Ratos

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando...

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Descreve-se um ensaio de diagnóstico potencialmente valiosa, que pode ser utilizada para decidir a retirada da imunossupressão após transplante sem risco elevado de rejeição do enxerto. O ensaio utiliza os princípios do tipo hipersensibilidade cutânea tardia e fornece uma avaliação precisa do dador respostas imunes efetoras e reguladoras específicas montadas pelos destinatários.

Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

O vídeo demonstra um método imunológico para monitorar in vivo a produção de linfócitos T citotóxicos induzidos por adjuvantes ou CTL. Um camundongo é pré-injetado com linfócitos T CD8 + de doadores proliferativos corados com corante geneticamente modificado. A injeção subcutânea de ovalbumina com adjuvantes gera linfócitos T CD8+ citotóxicos que são identificados pós-colheita por meio de imunomarcação e citometria de fluxo.

Uma técnica imunológica para monitorar a geração de linfócitos T citotóxicos mediados por adjuvantes

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Este relatório descreve um método para induzir o olho seco autoimune experimental crônico em ratos Lewis através da imunização com uma emulsão de extrato da glândula lacrimal de rato, ovalbumina e adjuvante completo de Freund, seguido da injeção de extrato da glândula lacrimal e ovalbumina na subconjunctiva forniceal e glândulas lacrimais Seis semanas depois.

Um modelo crônico de Rato de olho seco autoimune com aumento de células de memória E Effect no tecido do globo ocular

Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação e a administração estereotáxica de linfócitos humanos alogênico em camundongos imunodeficientes carregando humana ortotópico de tumores primários. Este estudo fornece um prova de conceito para a viabilidade e a eficácia antitumoral de imunoterapias celulares intrabrain-entregue.

Estereotáxica transferência adotiva de citotóxicas células imunes em modelos murino de humanos ortotópico Glioblastoma Multiforme Xenografts

A hipersensibilidade de contato (CHS) é um modelo experimental de murina de dermatite de contato alérgico (ACD). O CHS baseia-se na sensibilização com hapten reativo pintando a pele raspada do peito e abdômen, com um subsequente desafio da pele do ouvido com um hapten diluído, causando uma reação de inchaço que é avaliada de várias maneiras.

Entrar em contato com a Hipersensibilidade como modelo murino de dermatite de contato alérgico

O estudo demonstra o papel da pele na modulação das respostas imunes em camundongos por meio da imunização epicutânea (EC). A imunização contra CE com um antígeno proteico pode suprimir as respostas imunes na hipersensibilidade de contato ou reverter a supressão induzida pela pele quando combinada com padrões moleculares associados a patógenos. A imunização contra a CE mostra-se promissora como uma abordagem eficaz e sem agulha para a imunoterapia.

Modelo Murino de Imunomodulação Induzida por Epicutâneo

Aprenda a induzir e registrar reações de hipersensibilidade do tipo tardio na orelha de ratos usando microscopia de dois fótons. Este método permite visualizar células T efetoras e de memória in situ.

As células de memória efetoras T imagem no ouvido após a indução de DTH Adoptive

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