As células de memória efetoras T imagem no ouvido após a indução de DTH Adoptive

Olá, sou Melanie Matthew. Sou estudante de pós-graduação no laboratório Micah Hollins da Universidade da Califórnia em Irvine, no Departamento de Fisiologia e Biofísica. E hoje, junto com a Dra. Christine Beaton, vamos mostrar como imaginamos o efeito de resposta ou a população de células T de memória na orelha do rato.

A Dra. Christine Beaton primeiro induzirá DTH de hipersensibilidade do tipo retardado na orelha do rato. E então passaremos para imagens in situ da orelha do rato por duas microscopias fotográficas. Dois dias atrás, injetei GFP marcado com células T específicas de albumina em hiper para um Lewis.

E hoje vou desafiar o mesmo rato na orelha. Então, no ouvido direito, vou injetar albumina. E na orelha esquerda vou injetar um pouco de PBS.

A dose de albumina que estou injetando é de 20 microgramas em 20 microlitros. E a albumina que estou usando é uma mistura de um para um de Texas Red rotulado de albumina e não rotulado de albumina. Então, essa é a direita na qual vou mostrar como vou injetar.

Então eu tenho minha mão esquerda, sou destro. Então, na minha mão esquerda, tirei a luva para poder colocar um dedo embaixo da orelha e o outro acima para esticar a pele para que eu possa ver exatamente onde estou com a agulha e passar entre as duas camadas de pele no ar, que é muito fino. Então, para isso, eu uso agulhas de calibre 27 para ter algo extremamente fino para entrar lá.

Então, se eu der a volta por cima, você definitivamente verá para onde foi o vermelho do Texas e para onde foi o PBS. Então, agora estamos 42 horas após o desafio aqui e vou usar um micrômetro com mola para medir a espessura da orelha. Então, vou medir as duas orelhas, a orelha direita que foi desafiada com a albumina e a orelha esquerda que não foi desafiada e a diferença na sua espessura nos dará uma ideia da intensidade da inflamação.

Oh, 62 0 60 0 61, 0 60 ou 58 ou 57 ou 57. E a outra orelha 4 49 4 55 4 48,4 47 4 46, 4 50. Hi.So Christine Beaton acaba de nos dar o rato que ela removeu após medir a resposta DTH.

Nós os transportamos para cá no gelo. Esta é a orelha esquerda do rato. E estamos aqui agora no laboratório de Ian Parker fazendo microscopia de dois fótons.

Então, vou preparar essas orelhas para imagens in situ de dois fótons. Então, vou preparar uma das orelhas de rato aqui na base da orelha. O tecido é muito mais grosso e temos um pouco de cabelo para cima que vai ficar um pouco bagunçado se eu começar a cortá-lo.

Então, a primeira coisa que vou fazer é cortar um pouco desse cabelo. Estou apenas segurando suavemente a orelha. Meu dedo torna muito mais fácil controlar o tecido quando você o segura entre o polegar e o indicador.

Eu prefiro usar fórceps porque fórceps, eu meio que não consigo sentir o que o tecido está fazendo tão facilmente e estamos sempre preocupados em danificar o tecido. Então, queremos ser capazes de sentir o que estamos fazendo com isso. Então, eu gosto de usar meus dedos.

Esta é a camada dérmica descascando daqui na orelha do rato. Então, enquanto eu estava aparando um pouco do cabelo, consegui aparar suavemente algumas dessas dermes. Há algumas tesouras de dissecação muito pequenas para fazer isso, apenas algumas tesouras curvas bonitas.

Você não quer espetar o tecido e pode subir da base da orelha até o topo, apenas cortando suavemente alguma camada dérmica. Portanto, não precisamos de uma janela muito grande para imagens. Esta área aqui será suficiente para obter algumas, algumas boas imagens das células que se infiltram no tecido.

Então você pode ver que temos alguns vasos sanguíneos intactos ainda aqui na base da orelha e praticamente até a ponta da orelha. Toda essa área será muito boa para imagens de DTH. Então, vou cortar aquele pedaço de tecido que expus para fazer um pequeno pedaço de tecido que podemos colar em nosso estágio de imagem.

Então, basta fazer um corte aqui, invertê-lo. Eu posso cortar aqui. Temos um belo pedaço de tecido que podemos preparar em nosso escopo de dois fótons para imagens.

Estas são lamínulas de plástico inquebráveis que cortamos no tamanho do nosso tecido. E então montamos o tecido neles usando o vínculo de aposta. E então prendemos essas lamínulas de plástico inquebráveis usando graxa de silicone em nosso estágio de imagem in situ.

Vou pegar esse pequeno pedaço de tecido de ar, ele tem uma pequena curvatura, então vou ter que achatá-lo enquanto o colo. Não é o ideal, mas vai funcionar. Então você pega uma dessas lamínulas e a corta, meio que estima o tamanho da sua orelha e corta um pouco maior do que você acha que vai ser.

Para montar nosso tecido na lamínula. Usamos uma super cola segura para tecidos chamada bet long. Nós o pegamos da 3M e colocamos algumas gotas em nossa lamínula.

Eu não quero ter muito. E você também quer ter certeza de que está espalhado igualmente. Então, vou pegar um pequeno pedaço de papel para lentes e usar o canto dele para passar a cola na lamínula aqui.

Vou subir um pouco com a cola extra e assim que essa cola tocar na água, ela vai curar. Portanto, você deve ter muito cuidado com sua amostra de tecido. Então, vou pegar o canto do tecido aqui que provavelmente não vamos fazer a imagem porque está na parte curva.

Vou secar um pouco. A parte inferior, apenas no papel da lente, então está tudo seco. E eu vou tocar o canto dele, esse tecido de orelha de rato na lamínula.

E deve curar imediatamente onde eu toquei. O resto, vou achatar um pouco pressionando-o suavemente, as bordas dele. Então, espero que possamos ter um bom quadro de imagem.

Então, agora o que vou fazer é curar a cola mergulhando-a na mídia. Então, para evitar que a cola fique em cima do tecido, nós a viramos de cabeça para baixo e lentamente a mergulhamos em um canto primeiro em nosso reservatório de mídia e ela deve ser bem colada e podemos imaginá-la em nossa câmara de imagem de tecido. Então, agora vamos montar o pedaço de tecido que preparamos para imagens in situ, o pedaço de tecido de cerveja no palco.

Então, aqui está nosso pedaço de tecido com a graxa de silicone na parte inferior, e nós apenas o colocamos suavemente no fluxo de mídia. Agora está preso na parte inferior do palco está a graxa de silicone. Ilumine o fluxo de mídia com nossa sonda de temperatura ao lado dela.

E agora vamos nos concentrar. Então, vou ligar nosso foco, nova luz, nossa casca brilhante. Então, vou pegar nossa objetiva de 20 x e baixá-la para dentro da câmara.

Certifique-se de que não toque no tecido. Olhe através da ocular e concentre-se no tecido do ouvido. E aí está.

Aqui você vê folículos pilosos verdes autofluorescentes na camada dérmica da orelha do rato. Ao redor desses folículos pilosos há uma densa camada de colágeno. Esta é uma camada que removemos para a imagem de fótons T das células de memória do T fector.

Os folículos pilosos autofluorescentes obscurecerão a imagem como o colágeno brilhante da camada dérmica superior. Ok, então aqui você pode ver que temos APCs que absorveram o volin conjugado vermelho do Texas e estão aninhados ao longo dessas fibras de colágeno azul. As fibras de colágeno são azuis devido à geração de segundo harmônico que obtemos na imagem de fótons ao longo das fibras de colágeno.

Temos células altamente móveis. Eles rastejam para cima e para baixo nas fibras de colágeno e interagem com os APCs. Então, neste vídeo, você viu a Dra. Christine Beaton, induzir DTH adotivo no rato Lewis.

E então mostramos nossa preparação auditiva para imagens, as células de memória efetoras T responsivas e a orelha de rato e nossas duas técnicas de fótons para fazer isso.