Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Para estudar as interações do DNA da cromatina que governam a expressão gênica específica neuronal no cérebro humano, uma população pura de núcleos neuronais deve primeiro ser obtida para fazer isso. O tecido cerebral humano post-mortem é homogeneizado e os núcleos totais são isolados usando centrifugação por gradiente de densidade. Em seguida, os núcleos são marcados com anticorpos neuronais específicos isolados por meio de classificação métrica de fluxo e, finalmente, concentrados com ultracentrifugação.

Olá, sou Anish Matan do laboratório da Dra. Sharon mc Barian aqui no departamento de psiquiatria da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts. Hoje vou mostrar a vocês um procedimento para isolamento de núcleos neuronais do tecido cerebral humano post-mortem. Então vamos começar.

Para cada amostra de núcleo a ser classificada, comece com mil miligramas de tecido cerebral pós-mortal congelado. Com essa quantidade, você pode obter cerca de 5 milhões de núcleos neuronais após a classificação ativada por fluorescência. Para iniciar a extração dos núcleos, coloque 250 miligramas de tecido cerebral em um downer contendo cinco mils de tampão de lise e coloque-o no gelo.

Uma vez que o tecido descongela por um minuto enquanto está no gelo. Após a descida, transfira o tecido homogeneizado para um tubo de ultracentrífuga transparente de 15 mil e coloque o tubo no gelo. Repita essa homogeneização para o tecido restante.

Em seguida, pipete cuidadosamente nove mils de solução de sacarose para o fundo dos tubos de ultracentrífuga para estabelecer um gradiente de concentração de modo que a solução de tecido homogeneizado fique em cima da solução de sacarose. Agora pese os tubos da ultracentrífuga para garantir que estejam equilibrados durante a ultracentrifugação. Faça quaisquer ajustes no peso adicionando tampão de lise à camada superior Após a pesagem dos tubos, coloque-os na ultracentrífuga usando as amostras de ultracentrífuga de rotor SW 28 a 107163.6 RCF por 2.5 horas a quatro graus.

Quando a centrifugação estiver concluída, aspire o snat, bem como a camada de detritos encontrada no gradiente de concentração. Tenha cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo, que contém os núcleos. Em seguida, adicione 500 microlitros de um XPBS a cada pellet e deixe descansar no gelo por 20 minutos.

Após 20 minutos, resus suspenda os pellets pipetando para cima e para baixo. A incubação no gelo permite que os pellets se dissolvam um pouco por conta própria, o que facilita a ressuspensão dos núcleos, diminuindo assim a quantidade de estresse que os núcleos experimentam. Em seguida, transfira a suspensão e os núcleos para dois tubos de centrífuga.

Combine a solução nucleica de dois dos tubos ultra centage para cada tubo microcentrífico e, novamente, coloque as amostras no gelo. Agora que a extração nucleica está completa, vou passar para a etapa de imunocoloração para isolar os núcleos neuronais de fato, classificando a amostra contendo núcleos será incubada com uma mistura de imunocoloração composta de anticorpo primário e secundário, bem como bloqueando links para fazer a mistura de imunocoloração em 1,2 microlitros de anticorpo neuronal específico novo N para 300 microlitros de um XPBS. Em seguida, adicione cem microlitros de mistura de bloqueio, que contém 0,5% BS, A e 10% de soro de código normal em um XPBS.

Finalmente, adicione um microlitro do anticorpo secundário chamado LOR 4 88. Prepare também uma coloração imunológica para uma amostra de controle negativo para esta mistura de coloração imunológica. Exclua a nova extremidade do anticorpo primário e substitua-a por 1,2 microlitros de um XPBS.

Agora misturas de imunocoloração de vórtice e incube-as por cinco minutos em temperatura ambiente no escuro enquanto as misturas de coloração estão incubando. Preparar as amostras de núcleos de controlo para a amostra de controlo negativo Eloqua 20 microlitros dos núcleos de extensão resus num tubo de dois mil contendo 980 microlitros de um XPBS. Prepare também um controle não corado, que contenha apenas a solução de núcleos e PBS.

Agora Eloqua 20 microlitros dos núcleos em outro tubo e aumente o volume de volta para um mil com um XPBS. Em seguida, coloque todas as amostras de volta no gelo. Até agora, as misturas de coloração imunológica estão concluídas.

Incubação: adicione 401 microlitros da mistura na amostra apropriada. A amostra de núcleos recebeu a mistura contendo novos e LOR 4 88. A amostra de controlo negativa recebeu uma mistura contendo apenas o anticorpo secundário LOR 4 88, enquanto não foi adicionada qualquer coloração imunológica à amostra de controlo não corada.

Em seguida, transfira as amostras para o coldron e gire-as no escuro por 45 minutos. Agora que a incubação de 45 minutos está concluída, levarei as amostras até a instalação central de citometria de fluxo da Faculdade de Medicina da Universidade de Massachusetts para fazer alguma classificação ativada por fluorescência Durante o transporte para a instalação central, as amostras devem ser mantidas no gelo e no escuro. Na instalação central de citometria de fluxo, as amostras são primeiro filtradas através de um filtro de 40 mícrons e, em seguida, passam pelo instrumento por alguns minutos enquanto são mantidas frias.

Isso é feito para obter alguns dados preliminares antes da classificação. O controle não corado estabelece o grau de fluorescência negativa. Com base nessas informações, ajuste a sensibilidade da máquina à fluorescência.

O controle corado é usado para controlar a gripe. Qualquer ruído de fundo devido à fluorescência neste ponto define as portas apropriadas necessárias para a classificação. Várias portas diferentes são usadas para classificar as amostras.

Aqui estão alguns dados típicos para o primeiro portão. Este gráfico de análise de fax mostra uma amostra representativa após o ajuste do portão. A primeira porta reconhece padrões de detritos e núcleos viáveis com base em uma combinação de configurações, como fluorescência e experiência visual geral.

O eixo x representa a dispersão direta, que corresponde ao tamanho relativo, enquanto o eixo Y é responsável pela dispersão do local, que leva em conta a complexidade interna, como granularidade. A primeira porta também pode dar uma ideia do tamanho dos diferentes núcleos encontrados em nossa amostra. Isso permite separar os detritos dos núcleos reais, e aqui estão alguns dados típicos da segunda porta.

Este gráfico de fax mostra um exemplo de uma segunda porta, que permite classificar os núcleos individualmente enquanto descarta quaisquer agregados. Esta porta analisa as diferenças nos períodos de tempo que os núcleos levam para passar pelo laser. Aqueles que são agregados normalmente levam mais tempo para passar.

Este parâmetro específico é muito importante, pois a inclusão de agregados pode interferir na pureza, uma vez que alguns núcleos fluorescentes podem estar ligados a núcleos não fluorescentes. Finalmente, aqui estão os dados típicos do terceiro portão. Esta porta é definida para um comprimento de onda de fluorescência específico correspondente ao do flúor encontrado em nosso anticorpo secundário.

Neste gráfico de fax, você vê o nível de fluorescência ao longo do eixo x e um detector de canal vermelho profundo, PECY sete ao longo do eixo Y. Essas manchas de pontos fornecem uma visão melhor quando simplesmente comparadas a um histograma de uma única cor. A colocação do SCADA permite classificar e separar núcleos neuronais novos e positivos de núcleos não neuronais novos e negativos.

Depois que todas as portas são escolhidas, os núcleos são classificados em um XPBS. Uma vez que toda a amostra tenha passado pela classificação de fatos, verifique a pureza da classificação executando um Eloqua da amostra classificada através do instrumento. Aqui está um exemplo de um resultado ideal.

Aqui compare a amostra de pré-classificação, que contém uma população mista dos núcleos com o Eloqua classificado que eliminou a maioria dos núcleos negativos. Observe que as porcentagens de pureza são baseadas no número de eventos que contaminam a amostra com base nos portões que foram definidos. Lembre-se de que na primeira vez que a amostra é passada pela máquina, pode ocorrer algum branqueamento, causando algum escurecimento para compensar isso, alguns ajustes podem precisar ser feitos.

Uma vez que a amostra tenha sido classificada, comece a processar os núcleos. Para fazer isso, pegue 10 mils da amostra classificada e adicione dois mils de solução de sacarose, 50 microlitros de cloreto de cálcio de um molar e 30 microlitros de acetato de magnésio de um molar. Se houver menos de 10 mils de amostra classificada, aumente o volume para 10 mils adicionando um XPBS ou ajuste os materiais adicionais de acordo.

Em seguida, inverta a amostra várias vezes e coloque-a no gelo por 15 minutos. Após 15 minutos, amostra de característica centrífuga em um rotor de caçamba oscilante 1, 786 RCF por 15 minutos a quatro graus. Após centrifugação, aspirar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet branco encontrado no fundo do tubo.

Em seguida, dissolva o pellet em 200 microlitros da solução apropriada necessária para os experimentos anteriores. Nesse caso, estamos dissolvendo o pellet e o buffer de downing para o experimento subsequente de chips. Em seguida, ressuspenda o pellet por tubo para cima e para baixo.

Neste ponto, você pode transferir os núcleos para um tubo menor e colocá-lo em um freezer de 80 graus Celsius negativos. Até uso posterior, bem, acabei de mostrar como isolar núcleos neuronais do tecido cerebral humano post-mortem. Com esses núcleos, você pode realizar várias análises diferentes, como a imunoprecipitação da cromatina.

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar de sempre manter suas amostras no gelo, pois as células nucleares não são fixadas e podem se degradar a longas temperaturas. Além disso, é importante manusear o tecido humano no nível de biossegurança dois ou padrões de segurança superiores. Então é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.