Name: Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a isolar núcleos neuronais de tecido cerebral humano postmortem usando centrifugação em gradiente de densidade e citometria de fluxo. Este método permite estudar interações cromatínicas e expressão gênica específica de neurônios.

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Os autores agradecem o aconselhamento e apoio técnico fornecido pelo Dr. Richard Konz e pessoal nas instalações Núcleo Citometria de Fluxo na Universidade de Massachusetts Medical School. Recursos suportados pelo núcleo de Endocrinologia Diabetes Research Center Grant DK032520 também foram utilizados. Este trabalho é suportado por concessões do National Institute of Mental Health (NIMH), do Instituto Nacional de Abuso de Drogas (NIDA) e do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano.

Extração de núcleos <ol><li> Colocar 250 mg de tecido congelado cérebro pós-morte em 5 mL de Lise um tampão em um douncer e colocá-lo no gelo. Para receber cerca de 5 milhões núcleos após FACS triagem, geralmente usamos 1000 mg de tecido por amostra. </li><li> Uma vez que o tecido tem descongelado, Dounce o tecido por 1 minuto enquanto no gelo. </li><li> Pegue o tecido homogeneizado e colocá-lo em um tubo de ultracentrífuga 15 mL claro. Colocar o tubo em gelo. </li><li> Tome 9 mL da solução de sacarose 2 com uma pipeta, coloque a pipeta no fundo do tubo de ultracentrífuga claro, e liberar a solução de sacarose 2 para criar um gradiente de concentração com a solução de tecido homogeneizado em cima da solução de sacarose 2. </li><li> Pesar os tubos de ultracentrífuga para se certificar de que todos eles vão ser equilibrada ao girar dentro da ultracentrífuga. Faça os ajustes para o peso pela adição de Tampão de Lise 1 para a camada superior. </li><li> Após os tubos foram pesadas, colocá-los em baldes do rotor. </li><li> Coloque todos os baldes em um rotor SW28 e coloque cuidadosamente o rotor para a ultracentrífuga. </li><li> Ultracentrífuga as amostras em 107.163,6 RCF por 2,5 horas a 4 ° C. </li><li> Uma vez que a centrifugação for concluída, remova o sobrenadante, juntamente com a camada de detritos encontrados no gradiente de concentração, com a utilização de um vácuo, tomando cuidado para não perturbar o pellet contendo os núcleos na parte inferior do tubo. </li><li> Adicionar 500 mL de 1X PBS a cada pellet e deixe descansar na geladeira por 20 minutos. Isso permite que o pellet para dissolver um pouco por conta própria, tornando mais fácil para depois dissolvê-lo mecanicamente por pipetagem cima e para baixo, o que diminui a quantidade de estresse a experiência dos núcleos. </li><li> Após os núcleos têm incubadas no gelo por 20 minutos, mecanicamente pipeta cima e para baixo para dissolver completamente os núcleos dentro 1XPBS. </li><li> Remover a solução contendo núcleos dos tubos de ultracentrifugação e combinar o conteúdo de dois tubos em um único tubo de microcentrífuga 2 mL. Novamente, coloque as amostras em gelo. </li></ol> Imunomarcação para FACS <ol><li> Neste ponto, faça uma mistura composta imunomarcação do anticorpo primário e secundário, e Bloqueio Mix. Para cada amostra, combine 300 mL de 1XPBS contendo 1,2 mL de anticorpo NeuN, 100 mL da mistura de bloqueio, que contém BSA 0,5% e soro de cabra normal em 10% 1XPBS, e 1 mL de Alexa Fluor 488. Para as amostras controle, excluir a NeuN anticorpo primário e, em vez disso, basta adicionar 1XPBS mais. </li><li> Vortex da mistura imunocoloração e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente no escuro. </li><li> Enquanto a mistura de coloração é a incubação, fazer os controles para as amostras. FACS para triagem, uma amostra, contendo núcleos só, chamado de &quot;controle sem mácula&quot; é necessário, uma segunda amostra, um controle negativo, contendo os núcleos com o anticorpo secundário Alexa Fluor 488 sem o anticorpo primário NeuN também é necessário. </li><li> ML alíquota 20 dos núcleos contendo solução para um tubo de microcentrífuga contendo 2 mL 1XPBS para o controle sem manchas, e outro 20 mL para outro tubo de 2 ml contendo 980 uL de 1XPBS para o controle negativo. Aumentar o volume dos núcleos contendo amostra de volta até 1 mL com 1XPBS. Todas as amostras são colocadas de volta no gelo. </li><li> Agora que a mistura imunocoloração terminou incubação, adicione o seu conteúdo de 401 mL em amostras adequadas. A amostra núcleos receberão a mistura contendo ambos os NeuN e Alexa Fluor 488, enquanto a amostra negativa receberá a mistura contendo apenas o anticorpo secundário Alexa Fluor 488. </li><li> Tomar as amostras para a sala fria para rodar no escuro por 45 minutos. </li><li> Depois que as amostras têm incubadas no escuro por 45 minutos, colocá-los no gelo e trazê-los para a instalação FACS. Durante o transporte para a instalação FACS, as amostras devem ser mantidas no gelo e no escuro. </li></ol> FACS <ol><li> Na instalação FACS, filtro as amostras através de um filtro de 40 um. Então, executá-los através do instrumento por alguns minutos, enquanto sendo mantido frio, a fim de obter alguns dados preliminares antes da separação. </li><li> Neste ponto, é necessário definir as portas adequadas para a classificação. Várias portas diferentes são usados ​​para amostras tipo. O primeiro portão dá uma idéia do tamanho dos núcleos diferentes encontrados dentro da amostra, e permite separatation de detritos de núcleos reais. O segundo portão nos permite classificar os núcleos individualmente. Descartar qualquer agregados são descartados neste momento. Finalmente, o terceiro portão é definido para um determinado comprimento de onda de fluorescência, correspondente ao do fluorocromo encontrada na nossa anticorpo secundário. Colocando esse portão que nos permite classificar e + NeuN separado, portanto núcleos neuronais de NeuN - núcleos. </li><li> Depois de todas as portas são escolhidos, os núcleos podem ser classificados em 1XPBS. </li><li> Uma vez que oamostra total passou, verificar a pureza da espécie, executando uma alíquota da amostra classificadas através do instrumento. Certifique-se que fluorescence da amostra não se espalha, mas é contido dentro de um único quadrante. É melhor escolher amostras que são mais de 90% pura. </li></ol> Depois FACS <ol><li> Uma vez que a amostra foi classificada, o processamento dos núcleos pode começar. Tomar 10 mL de amostra classificados e adicionar-lhe 2 mL da solução de sacarose 2, 50 uL de 1M CaCl 2 e 30 ul de 1m Mg (Ace) 2. Como um lembrete, certifique-se sempre manter a amostra em gelo desde os núcleos são corrigidos. </li><li> Se houver menos de 10 mL de amostra classificados, aumentar o volume até 10 mL, adicionando 1XPBS, ou ajustar a materiais adicionais em conformidade. </li><li> Inverter a amostra várias vezes e colocar no gelo por 15 minutos. </li><li> Após as amostras terem incubado em gelo por 15 minutos, centrifugar-los em um balde de rotor swing em 1786 RCF por 15 minutos a 4 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante com o uso de um vácuo, sem perturbar o sedimento branco encontrado na parte inferior do tubo. </li><li> Dissolver o sedimento em 200 mL de qualquer solução que você precisa para os experimentos de prosseguir, e pipetar cima e para baixo. </li><li> Transferir a solução para um pequeno tubo e colocá-lo no freezer -80 ° C até à sua utilização. </li></ol>

<ol><li>Siegmund, K. D., Connor, C. M., Campan, M., Long, T. I., Weisenberger, D. J., Biniszkiewicz, D., Jaenisch, R., Laird, P. W., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+in+the+human+cerebral+cortex+is+dynamically+regulated+throughout+the+life+span+and+involves+differentiated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">DNA methylation in the human cerebral cortex is dynamically regulated throughout the life span and involves differentiated neurons.</a> PLoS ONE. 2, 895-895 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Acevedo, L. G., Iniguez, A. L., Holster, H. L., Zhang, X., Green, R., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+ChIP-chip+analysis+using+10%2C000+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells.</a> Biotechniques. 43, 791-797 (2007).</li>
</ol>

O protocolo aqui apresentado deve ser particularmente útil para os estudos focados em mudanças epigenéticas da cromatina neuronal e, mais genericamente, sobre o fenótipo molecular do núcleo neuronal, durante a doença em desenvolvimento e envelhecimento, ou em condições normais neurológicos ou psiquiátricos. O método é uma vantagem particular quando a heterogeneidade celular de tecido do cérebro, incluindo mudanças potenciais no neurônio-glia de-ração durante o curso do envelhecimento ou devido a doenças são uma preocupação 1. Por...

Reagentes: <table><tr><th colspan="3" align="left"> 1. Tampão de Lise </th></tr><tr><td> 0.32M </td><td> Sacarose </td><td> 5,47 g </td></tr><tr><td> 5 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 250 L </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 mL </td></tr><tr><td> 0,1 mM </td><td> EDTA </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 10mM </td><td> Tris-HCl, PH8 </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 mL </td></tr><tr><td> 0,1% </td><td> Triton X-100 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o volume para 50 ml com água esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 2. Solução de sacarose </th></tr><tr><td> 1,8 M </td><td> Sacarose </td><td> 30,78 g </td></tr><tr><td> 3 mM </td><td> Mg (acetato) 2 </td><td> 150 mL </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> TDT </td><td> 17 mL </td></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris-HCl, PH8 </td><td> 500 mL </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o volume para 50 ml com água esterilizada </td></tr></table><table><tr><th colspan="3" align="left"> 3. Dounce tampão </th></tr><tr><td> 10 mM </td><td> Tris </td><td> 0,242 g </td></tr><tr><td> 4 mM </td><td> MgCl 2 </td><td> 0,163 g </td></tr><tr><td> 1 mM </td><td> CaCl 2 </td><td> 0,03 g </td></tr><tr><td colspan="3" align="center" style="padding:8px 0 16px 0"> Ajustar o pH para 7,5 e volume para 200 ml com água esterilizada </td></tr></table>

isolamento núcleos neuronais de tecidos humanos postmortem cérebro

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurônios no cérebro humano se tornar pós-mitóticos em grande parte durante o desenvolvimento pré-natal, e assim manter seus núcleos em todo o ciclo de vida completo. No entanto, pouco se sabe sobre as alterações na cromatina nuclear neuronal e na organização durante o curso do desenvolvimento e envelhecimento, ou doença neuropsiquiátrica crônica. No entanto, a data mais cromatina e DNA ensaios com base (que não FISH) a falta de resolução única célula. Para este fim, a uma considerável heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa, porque normalmente várias subpopulações de neurônios são misturados com diferentes tipos de células gliais e outras células não-neuronais. Uma possível solução seria a crescer células tipo culturas específicas, mas a maioria das células do SNC, incluindo os neurônios, são ex vivo sustentável, na melhor das hipóteses, por apenas algumas semanas e assim proporcionaria um modelo incompleto de mecanismos epigenéticos potencialmente operacional em todo o ciclo de vida completo . Aqui, nós fornecemos um protocolo para extrair e purificar a partir de núcleos congelados do cérebro pós-morte (nunca fixo) humana. O método envolve a extração de núcleos em tampão de lise hipotônica, seguido por ultracentrifugação e immunotagging com anti-NeuN anticorpos. Rotulados núcleos neuronais são então recolhidos separadamente usando fluorescência ativado classificação. Este método deve ser aplicável a qualquer região do cérebro em uma ampla gama de espécies e adequado para estudos de imunoprecipitação de cromatina com local e modificação específica anticorpos anti-histonas, e para a metilação do DNA e outros ensaios.

A heterogeneidade celular de tecido cerebral representa uma limitação significativa para o estudo de marcas epigenéticas na cromatina porque a maioria dos ensaios falta de resolução única célula. Neurônios são normalmente misturados com glia e outras células não-neuronais. Nós fornecemos um protocolo para extrair e coletar núcleos neuronal do cérebro humano.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Os neurônios no cérebro humano tornam-se pós-mitóticos predominantemente durante o desenvolvimento pré-natal e, portanto, mantêm seus núcleos durante toda a vida. No entanto, ...

Para estudar as interações entre DNA da cromatina que regulam a expressão gênica específica de neurônios no cérebro humano, é necessário primeiro obter uma população pura de núcleos neuronais. O tecido cerebral humano post-mortem é homogeneizado e os núcleos totais são isolados por meio de centrifugação em gradiente de densidade. Em seguida, os núcleos são marcados com anticorpos específicos de neurônios e isolados por meio de ordenação citométrica de fluxo, e finalmente concentrados por ultracentrifugação.Olá, sou Anish Matan do laboratório da Dra. Sharon mc Barian, aqui no departamento de psiquiatria da Escola de Medicina da Universidade de Massachusetts. Hoje vou mostrar um procedimento para o isolamento de núcleos neuronais a partir de tecido cerebral humano pós-mortem. Vamos começar.Para cada amostra de núcleos a ser classificada, comece com mil miligramas de tecido cerebral post-mortem congelado. Com essa quantidade, é possível obter cerca de 5 milhões de núcleos neuronais após a classificação ativada por fluorescência. Para iniciar a extração de núcleos, coloque 250 miligramas de tecido cerebral em um dounce contendo cinco mililitros de tampão de lise e coloque-o no gelo.Uma

neuronal-nuclei-isolation-from-human-postmortem-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nós descrevemos um processo que utiliza laser de captura de microdissecção para isolar e extrair RNA de uma população de células homogêneas, neurônios piramidais, na camada III do giro temporal superior em cérebros post-mortem humano. Nós posteriormente linearmente amplificar (T7-based) mRNA, e hibridizar a amostra para o ser humano Affymetrix X3P microarray.

Obtenção de RNA de alta qualidade a partir de populações de células no tecido humano único post-mortem do cérebro

Núcleos cardíaca são isolados através de sedimentação densidade e immunolabeled com anticorpos contra o material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar e classificar os núcleos dos cardiomiócitos por citometria de fluxo.

Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

Este vídeo descreve o protocolo para isolar núcleos únicos de tecido de glioma fresco congelado. Os núcleos únicos isolados podem ser usados como espécimes para técnicas de sequenciamento, como sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA) e sequenciamento de ensaio de núcleo único para cromatina acessível por transposase (snATAC) para obter insights mais profundos sobre a heterogeneidade inter e intratumoral observada no glioma dos tecidos nervosos centrais.

Isolamento de Núcleos de Tecidos de Glioma Frescos Congelados: Um Método para Obter Núcleos Intactos de Amostras de Tumores de Glioma

O vídeo demonstra um método para isolar núcleos intactos de células gliais e estaminais no giro dentado do hipocampo de camundongos (DG). O tecido DG é mecanicamente dissociado em um tampão de homogeneização a frio para liberar os núcleos. Detritos teciduais e outras organelas liberadas são descartados, e os núcleos são corados com uma coloração de DNA e um anticorpo conjugado com fluoróforo específico para o antígeno nuclear neuronal (NeuN). A classificação de núcleos ativados por...

Uma técnica para isolar núcleos de células não neuronais no giro dentado do hipocampo

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar e classificar núcleos de tecido cerebral humano recém-congelado usando classificação de núcleos ativados por fluorescência (FANS), que permite o estudo de diferentes populações de células para várias aplicações neurológicas.

Isolando populações de células do tecido cerebral usando classificação de núcleos ativados por fluorescência

A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Desenvolvemos um método que enriquece e isola populações de astrócitos humanos de tecido fresco congelado para uso em análises moleculares a jusante.

Isolamento de populações de astúcitos humanos adultos do córtex congelado fresco usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência

Apresentado aqui é um método para sequenciar núcleos únicos isolados do giro dentado do rato que exclui a maioria dos neurônios através da classificação de núcleos ativados por fluorescência (FAN). Essa abordagem gera perfis de expressão de alta qualidade e facilita o estudo da maioria dos outros tipos de células representadas no nicho, incluindo populações escassas, como células-tronco neurais.

Classificação negativa de neurônios por núcleos ativados por fluorescência combinada com sequenciamento de RNA de núcleos únicos para estudar o nicho neurogênico do hipocampo

O estudo descreve um protocolo simples, rápido e parcialmente automatizado para isolar núcleos de alta qualidade de tecidos congelados de mamíferos para sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante.

Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Aprenda a isolar núcleos neuronais de tecido cerebral humano postmortem usando centrifugação em gradiente de densidade e citometria de fluxo. Este método permite estudar interações cromatínicas e expressão gênica específica de neurônios.

Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

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