Isolamento Núcleos neuronais de Tecidos Humanos Postmortem Cérebro

Para estudar as interações entre DNA da cromatina que regulam a expressão gênica específica de neurônios no cérebro humano, primeiramente é necessário obter uma população pura de núcleos neuronais para isso. O tecido cerebral humano post mortem é homogeneizado e os núcleos totais são isolados por meio de centrifugação em gradiente de densidade. Em seguida, os núcleos são marcados com anticorpos específicos de neurônios isolados por meio de ordenação por citometria de fluxo e, finalmente, concentrados por ultracentrifugação.

Olá, sou Anish Matan do laboratório da Dra. Sharon mc Barian, aqui no departamento de psiquiatria da Escola de Medicina da Universidade de Massachusetts. Hoje vou mostrar um procedimento para o isolamento de núcleos neuronais a partir de tecido cerebral humano pós-mortem. Vamos começar.

Para cada amostra de núcleos a ser separada, comece com mil miligramas de tecido cerebral post-mortem congelado. Com essa quantidade, é possível obter cerca de 5 milhões de núcleos neuronais após a separação ativada por fluorescência. Para iniciar a extração de núcleos, coloque 250 miligramas de tecido cerebral em um dounce contendo cinco mililitros de tampão de lise e coloque-o no gelo.

Uma vez que o tecido descongele, deixe-o por um minuto sobre gelo. Após esse período, transfira o tecido homogeneizado para um tubo transparente de ultracentrifugação de 15 mL e coloque o tubo sobre gelo. Repita essa homogeneização para o tecido restante.

Em seguida, pipete cuidadosamente nove mililitros da solução de sacarose no fundo dos tubos de ultracentrifugação para montar um gradiente de concentração, de modo que a solução do tecido homogeneizado fique sobre a solução de sacarose. Agora, pese os tubos de ultracentrifugação para garantir que estejam balanceados durante a ultracentrifugação. Faça os ajustes de peso adicionando tampão de lise à camada superior. Após a pesagem dos tubos, coloque-os na ultracentrífuga utilizando o rotor SW 28 e centrifugue as amostras a 107163,6 ×g por 2,5 horas a quatro graus Celsius.

Após a conclusão da centrifugação, aspire o sobrenadante, bem como a camada de detritos encontrada no gradiente de concentração. Tenha cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo, que contém os núcleos. Em seguida, adicione 500 microlitros de um XPBS a cada pellet e deixe em gelo por 20 minutos.

Após 20 minutos, ressuspenda os pellets pipetando para cima e para baixo. A incubação em gelo permite que os pellets se dissolvam um pouco por conta própria, o que facilita a ressuspensão dos núcleos, diminuindo assim a quantidade de estresse à qual os núcleos são submetidos. Em seguida, transfira a ressuspensão e os núcleos para dois tubos de centrífuga de mil.

Combine a solução nucleica de dois dos tubos de ultracentrífuga em cada tubo de microcentrífuga e, novamente, coloque as amostras no gelo. Agora que a extração de ácidos nucleicos está concluída, vou prosseguir para a etapa de imunomarcação, a fim de isolar núcleos neuronais por triagem FACS. A amostra contendo núcleos será incubada com uma mistura de imunomarcação composta por anticorpos primário e secundário, bem como soluções bloqueadoras. Para preparar a mistura de imunomarcação, adicione 1,2 microlitros do anticorpo específico neuronal NeuN a 300 microlitros de PBS 1X. Em seguida, adicione 100 microlitros da mistura bloqueadora, que contém 0,5% de BSA e 10% de soro normal de cabra em PBS 1X.

Finalmente, adicione um microlitro do anticorpo secundário chamado LOR 4 88. Prepare também uma coloração imunológica para uma amostra de controle negativo dessa mistura de coloração imunológica. Exclua o anticorpo primário new end e substitua-o por 1,2 microlitros de um XPBS.

Agora, agite as misturas de imunomarcação por vortex e incube-as por cinco minutos à temperatura ambiente, no escuro, enquanto as misturas de coloração estão incubando. Prepare as amostras de núcleos controle para a amostra controle negativa: adicione 20 microlitros dos núcleos ressuspendidos à Eloqua em um tubo de dois mil contendo 980 microlitros de PBS 1X. Prepare também um controle não corado, que contém apenas a solução de núcleos e PBS.

Agora elua 20 microlitros dos núcleos para outro tubo e reajuste o volume novamente para um mil com uma XPBS. Em seguida, coloque todas as amostras de volta no gelo. Neste momento, as misturas de imunomarcação já estão prontas.

Incubar, adicionando 401 microlitros da mistura à amostra apropriada. A amostra de núcleos recebeu a mistura contendo tanto o novo anticorpo quanto o LOR 4 88. A amostra controle negativo recebeu uma mistura contendo apenas o anticorpo secundário LOR 4 88, enquanto nenhum corante imunológico é adicionado à amostra controle não corada.

Em seguida, transfira as amostras para o coldron e gire-as no escuro por 45 minutos. Agora que a incubação de 45 minutos está concluída, levarei as amostras até a instalação central de citometria de fluxo da Escola de Medicina da Universidade de Massachusetts para realizar uma triagem ativada por fluorescência. Durante o transporte até a instalação central, as amostras devem ser mantidas sobre gelo e no escuro. Na instalação central de citometria de fluxo, as amostras são primeiramente filtradas através de um filtro de 40 microns e, em seguida, são analisadas no instrumento por alguns minutos, mantendo-as frias.

Isso é feito para obter alguns dados preliminares antes da triagem. O controle não corado estabelece o grau de fluorescência negativa. Com base nessas informações, ajuste a sensibilidade da máquina à fluorescência.

O controle corado é utilizado para controlar a fluorescência. Qualquer ruído de fundo devido à fluorescência neste ponto define os limites apropriados necessários para a separação. Vários limites diferentes são usados para separar as amostras.

Aqui estão alguns dados típicos para o primeiro gate. Este gráfico de análise de fax mostra uma amostra representativa após o ajuste do gate. O primeiro gate reconhece padrões de detritos e núcleos viáveis com base em uma combinação de parâmetros, como fluorescência e experiência visual geral.

O eixo x representa a dispersão para a frente, que corresponde ao tamanho relativo, enquanto o eixo Y representa a dispersão lateral, que indica a complexidade interna, como a granularidade. O primeiro gate também pode fornecer uma ideia do tamanho dos diferentes núcleos encontrados em nossa amostra. Isso permite separar os detritos dos núcleos reais, e aqui estão alguns dados típicos do segundo gate.

Este gráfico de fax mostra um exemplo de um segundo portão, que permite classificar núcleos individualmente enquanto descarta quaisquer agregados. Este portão analisa as diferenças nos intervalos de tempo que os núcleos levam para passar pelo laser. Aqueles que são agregados normalmente levam mais tempo para atravessar.

Esse parâmetro específico é muito importante, pois a inclusão de agregados pode interferir na pureza, já que alguns nucleotídeos fluorescentes podem estar ligados a outros não fluorescentes. Por fim, aqui estão dados típicos do terceiro gate. Esse gate é ajustado a um comprimento de onda de fluorescência específico, correspondente ao do fluoróforo presente em nosso anticorpo secundário.

Neste gráfico de fax, você observa o nível de fluorescência ao longo do eixo x e um detector de canal vermelho profundo, PECY sete, ao longo do eixo y. Esses dot blots fornecem uma visualização melhor quando comparados simplesmente a um histograma de cor única. O uso de SCADA permite classificar e separar núcleos neuronais novos e positivos de núcleos não neuronais novos e negativos.

Após a seleção de todas as portas, os núcleos são classificados em um único XPBS. Depois que toda a amostra tiver passado pelo processo de classificação, verifique a pureza da separação realizando uma análise Eloqua da amostra classificada no instrumento. A seguir, um exemplo de um resultado ideal.

Aqui, compare a amostra pré-classificada, que contém uma população mista de núcleos, com o Eloqua classificado, que eliminou a maioria dos núcleos negativos. Observe que as porcentagens de pureza são baseadas no número de eventos que contaminam a amostra, de acordo com os gates definidos. Tenha em mente que, na primeira vez em que a amostra é analisada no equipamento, pode ocorrer algum clareamento, o que provoca um certo escurecimento; para levar isso em consideração, alguns ajustes podem ser necessários.

Uma vez que a amostra tenha sido separada, inicie o processamento dos núcleos. Para isso, retire 10 mililitros da amostra separada e adicione dois mililitros de solução de sacarose, 50 microlitros de cloreto de cálcio 1 molar e 30 microlitros de acetato de magnésio 1 molar. Se houver menos de 10 mililitros da amostra separada, aumente o volume até 10 mililitros adicionando um XPBS ou ajuste os materiais adicionais proporcionalmente.

Em seguida, inverta a amostra várias vezes e coloque-a no gelo por 15 minutos. Após 15 minutos, centrifugue a amostra em rotor de balde oscilante a 1.786 RCF por 15 minutos a quatro graus. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet branco localizado no fundo do tubo.

Em seguida, dissolva o pellet em 200 microlitros da solução apropriada necessária para os experimentos anteriores. Neste caso, estamos dissolvendo o pellet no buffer de diluição para o experimento de chip subsequente. Em seguida, re-suspenda o pellet pipetando para cima e para baixo.

Neste momento, você pode transferir os núcleos para um tubo menor e colocá-lo em um congelador a menos 80 graus Celsius. Até uso posterior, bem, acabei de mostrar como isolar núcleos neuronais de tecido cerebral humano pós-mortem. Com esses núcleos, você pode realizar diversas análises diferentes, como a imunoprecipitação de cromatina.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de manter sempre suas amostras em gelo, já que os núcleos estão não fixados e podem degradar-se em temperaturas elevadas. Além disso, é essencial manipular tecidos humanos segundo normas de segurança biológica nível dois ou superiores. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.