Um Ensaio Comportamental para Medida de capacidade de resposta a alterações em Zebrafish intensidades de luz

No laboratório Dowling, estudamos a fisiologia e o desenvolvimento da retina em peixes-zebra para determinar se mutantes de peixes-zebra incapazes de detectar movimento conseguem detectar luz e não são cegos. Para isso, testamos sua resposta motora visual ou VMR. Coletamos peixes-zebra por volta de quatro dias após a fertilização.

Coloque-os em placas de 96 poços, prepare um sistema adequado para imageamento, alinhe o software de rastreamento de vídeo com a placa e, em seguida, rastreie a resposta motora dos peixes após transições de luz para escuridão ou de escuridão para luz, o que chamamos de RMV. Olá, sou Farida Imran do laboratório de John Dowling e do Departamento de Biologia Molecular e Celular da Universidade de Harvard.

E eu sou Jason Rio. Sou do laboratório de Alexander Shear, também no departamento de biologia molecular e celular da Universidade de Harvard. Hoje vamos mostrar a resposta motora visual em peixes-zebra a incrementos e decrementos de luz.

Então vamos começar. Para iniciar o ensaio de resposta motora visual, primeiro cultive larvas de peixe-zebra selvagens sob um ciclo escuro-luz a 28 graus Celsius até pelo menos quatro dias após a fertilização. Nosso ciclo típico de luz e escuro é de 14 horas com luz acesa, começando às 9:00, e 10 horas com luz apagada, começando às 23:00, para obter os melhores resultados comportamentais.

Evite o excesso de larvas. Normalmente mantemos não mais do que 50 larvas em um único recipiente de Petri. Após cinco dias pós-fertilização, transferimos os peixes-zebra para uma placa de 96 poços com volume de poço de 650 microlitros, a fim de proporcionar maior espaço para natação às larvas.

Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira cuidadosamente uma larva por poço. Após transferir os peixes para os poços, complete cada poço com água suficiente para peixes de modo que a superfície da água fique quase no nível superior dos poços. Tenha cuidado para não encher em excesso ou insuficientemente os poços, a fim de evitar problemas ópticos para a câmera de gravação.

Também tenha cuidado para não introduzir bolhas nas cavidades. Os peixes estão agora prontos para serem monitorados quanto às suas respostas locomotoras à luz e à escuridão. Vamos levar os peixes-zebra em placa até o aparelho de gravação.

Então, vamos prosseguir examinando o aparelho de gravação. A placa de 96 poços contendo os peixes será colocada dentro da câmara de gravação, nesta bandeja branca, e mantida no lugar com uma mola ou elástico. A câmera está posicionada na parte traseira da caixa aqui e é focalizada na placa usando espelhos localizados na parte superior da caixa, aqui.

O ângulo desses espelhos pode ser ajustado girando os parafusos que mantêm os espelhos no lugar. A câmara de gravação é iluminada desde a base por LEDs de infravermelho. Isso permite que a câmera grave os peixes mesmo no escuro.

As larvas não conseguem detectar luz infravermelha, portanto essa iluminação infravermelha constante não afeta o experimento. LEDs brancos também iluminam a câmara de gravação por baixo. Eles são controlados separadamente das luzes infravermelhas para experimentos que duram mais de algumas horas.

A câmara pode ser preenchida com água corrente suave para ajudar a manter uma temperatura constante durante a duração do experimento. A água é bombeada a partir de um reservatório por uma pequena bomba de aquário e aquecida a 28 graus com um aquecedor subaquático típico de aquário. A água escoa por um orifício de drenagem grande e é recirculada de volta ao reservatório para minimizar vibrações estranhas provenientes do ambiente.

A unidade de gravação inteira é colocada sobre uma mesa de balanceamento pesada. Quando o aparelho de gravação estiver pronto, uma tampa de caixa é usada para cobrir os animais e isolá-los ainda mais da luz. Agora vamos prosseguir com o alinhamento do 96.

Placa de poços com a grade do software de rastreamento de vídeo no computador para este primeiro passo, coloque a placa de 96 poços contendo os peixes na câmara de gravação. Ao utilizar um banho-maria para experimentos de longo prazo, coloque lentamente a placa na água, permitindo que o nível da água se ajuste sem derramar sobre a placa. No software de rastreamento de vídeo, verifique se todas as larvas e o experimento estão visíveis na tela do computador.

Usando os controles do software, alinhe a grade do software de rastreamento de vídeo com os poços da placa de 96 poços, de modo que cada peixe fique dentro de um quadrado da grade. Esta etapa é muito importante para todas as suas gravações. O computador de rastreamento calculará o movimento separadamente para cada uma dessas caixas.

Portanto, se você alinhar incorretamente a grade do computador, alguns dos movimentos dos peixes podem ser perdidos ou, pior ainda, dois peixes adjacentes podem ocupar a mesma área e serem contados como um único peixe após o alinhamento. O momento em que as luzes acendem e apagam é programado no computador.

Normalmente, permitimos três horas de adaptação à escuridão mais clara dentro da caixa. Isso não apenas estabelece um nível de atividade basal, mas também dá às larvas a oportunidade de se acalmar após a pipetagem e manipulação. Em seguida, fechamos a porta da câmara de gravação e iniciamos a gravação.

Na prática, registramos a atividade de cada peixe por segundo, mas o software de análise na verdade grava os dados quadro a quadro. Abaixo, na tela, você pode ver um traçado em tempo real de um único peixe. Em termos de movimento em pixels, a linha branca indica que o número de mudanças de pixel está abaixo de um limiar definido, e a cor verde indica que a mudança de pixel está acima do valor definido para o limiar.

O valor do limiar dependerá em parte da sua câmera e configuração de iluminação específicas. Para a nossa configuração, normalmente utilizamos um limiar de quatro pixels. Ou seja, se menos de quatro pixels estiverem mudando, isso é considerado fundo.

Se mais de quatro pixels estiverem se movendo, isso indica que o peixe está em movimento. Determinamos empiricamente que esse limite detecta quase todos os movimentos de natação e mudança de direção das larvas. Embora as caixas de gravação isolem as larvas de forma razoavelmente eficaz, ainda assim desligamos a luz do ambiente e tomamos cuidado para minimizar interrupções com ruídos mecânicos, como abrir e fechar portas no cômodo, fazer uma festa dançante ou realizar nossas rotinas de exercícios.

Após a conclusão do experimento, transfira os dados coletados para uma planilha do Excel ou para o seu software favorito de análise. Assim é o aspecto dos dados. Eles contêm o tempo em segundos desde o início do experimento e a atividade de cada larva por segundo.

Aqui está um gráfico mostrando a atividade de uma única larva durante toda a duração do experimento, com várias respostas de ligado e desligado indicadas pelas setas no gráfico. Este gráfico mostra a atividade média de 40 peixes ao longo de toda a duração do experimento, com várias respostas de ligado e desligado conforme indicado pelas setas. Como é possível observar, as respostas de ligado e desligado são proeminentes e consistentes.

Este experimento de resposta motora visual também pode ser realizado com peixes mutantes. Para esses estudos, normalmente colocamos peixes selvagens e peixes mutantes na mesma placa, dispostos em um padrão de xadrez, para fins ideais de controle. Ao usar peixes mutantes na mesma placa que peixes selvagens, certifique-se de anotar qual tipo de peixe foi colocado em cada poço.

Aqui está uma sugestão sobre como acompanhar os peixes colocados em cada poço. Abaixo estão os resultados da resposta motora visual, que comparam larvas selvagens e mutantes. Novamente, observamos respostas acentuadas e consistentes de ativação e desativação nas larvas selvagens.

No entanto, as larvas mutantes chalk, que não apresentam desenvolvimento ocular, não aumentam significativamente sua atividade nem em resposta a incrementos nem a decrementos de luz e possuem um nível basal de atividade baixo. Esses resultados comparam as respostas do tipo selvagem com as dos mutantes NO OKR, também chamados de mutantes NRC. Acreditava-se que o mutante NRC fosse completamente cego com base no teste de OKR.

Utilizando o teste de resposta visual motora, demonstramos que o mutante NRC apresenta uma resposta de desligamento normal e uma resposta de ligamento retardada e lenta. Assim, o mutante NRC não é completamente cego, como se pensava anteriormente. Acabamos de mostrar a resposta motora visual de alevinos de peixe-zebra a incrementos e decrementos de luz.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de realizar o experimento durante o dia, pois os peixes são mais ativos e mais responsivos às mudanças na intensidade da luz durante o dia em comparação com a noite. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.