Name: Imunoprecipitação DNA metilado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Aprenda a técnica de imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP) para isolar fragmentos de DNA metilado de forma não enviesada. Este método é essencial para estudos de epigenética e investigação de mecanismos de doenças como o câncer.

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Queremos agradecer aos membros do Brown e laboratórios Lam pela sua participação na crítica a este vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research eo Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde.

EXTRAÇÃO DE DNA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DNA de uma variedade de diferentes amostras (células cultivadas fresca, congelada, bem como tecidos fixados em formalina incluído em parafina) podem ser usados ​​para MEDIP. É importante o uso de DNA altamente purificado, sem proteínas associadas, tais como histonas. Também é importante para remover RNA, tanto quanto possível a partir da amostra, como ele pode interferir tanto com a quantificação de DNA e ligação aos anticorpos. A quantidade de DNA usado para MEDIP pode variar de 200 ng de 1 mg, dependendo da quantidade de DNA disponíveis. Para demonstrar este protocolo, 1 mg de DNA será usado. O seguinte protocolo irá proporcionar alta qualidade do DNA fita dupla a partir de células cultivadas. Outros protocolos devem ser empregados para a extração de DNA de tipos de amostra outro. <ol><li> Adicionar 400 mL de tampão de digestão para um pellet de células em um tubo Eppendorf 1,7 ml. </li><li> Adicionar 100 mg de proteinase K para o tubo e incubar durante a 50 ° C. </li><li> Adicionar 500 mL de fenol pH 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Repita as etapas 3 a 5 uma vez. </li><li> Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Adicionar 40 mg de RNase A e incubar 1 hora a 37 ° C. </li><li> Adicionar 500 mL de fenol pH 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Repita as etapas 11 a 13 uma vez. </li><li> Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Adicionar volume 1/10th 3 M acetato de sódio (40 mL) e misture bem. </li><li> Adicionar 2 volumes (900 L) de etanol 100%, misture bem e coloque a -20 ° C por 20 minutos. </li><li> Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol, spin pulso, e remover o etanol residual. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol frio a 70% de lavar. Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol 70%, giro de pulso, e remover o etanol residual por pipetagem. </li><li> O ar seco do sedimento com a tampa aberta por 10 minutos em temperatura ambiente para remover todos os vestígios do etanol residual. </li><li> Ressuspender o DNA em 50 ul de dH2O esterilizado durante a noite a 4 ° C. </li><li> Quantificar o DNA utilizando um Espectrofotômetro NanoDrop. Um A 260: Uma relação de 280 de 1.8 é ideal. </li><li> Determinar a qualidade do DNA e faixa de tamanho em um gel de agarose com 100 bp ladder. Tão pouco como 10 ng de DNA genômico pode ser executado em um gel de agarose 1,7% seguido de coloração com um corante que é altamente sensível a pequenas quantidades de DNA, tais como ouro SYBR. </li><li> Em um tubo siliconizado por amostra, prepare 1 mg de DNA em um volume total de 50 l com o restante do volume composto esterilizado com dH 2 O. </li></ol> DNA sonicação DNA sonicação eo protocolo MEDIP deve ser realizada em tubos siliconzied para evitar a ligação específica de proteínas não às paredes do tubo. Vezes sonicação ideal para as amostras de DNA são baseados no grau de fragmentação da amostra de DNA determinado a partir de eletroforese em gel (Passo 27). Por exemplo, o DNA extraído de células em cultura deve ser de muito alto peso molecular, e, posteriormente, exigir mais do que sonicação DNA extraído de amostras de arquivo que são muitas vezes parcialmente degradada. Se as amostras são de uniformemente elevado peso molecular, é razoável neste momento a proceder à sonicação, conforme descrito neste protocolo sem verificar cada amostra individualmente. Se as amostras são fragmentados com amostras de arquivo, será necessário adaptar o procedimento de sonicação provavelmente por diminuir os tempos de sonicação para obter 300-100bp fragmentos. Se você esperar para processar as amostras que são parcialmente degradadas, otimização de parâmetros de sonicação pode ser realizada em uma amostra representativa daqueles de interesse. Com base no grau de fragmentação do DNA observados de eletroforese em gel (Passo 27), o experimentador pode predeterminar o tempo de sonicação ideal para a amostra. Aqui nós descrevemos um método para obter 300-1000 fragmentos de DNA bp por sonicação com um dispositivo automatizado sonicando (Bioruptor de Diagenode, UCD-200 TM) usando DNA de alto peso molecular. <ol><li> Água em Biorupter deve ser a 4 ° C. </li><li> Sonicate por 7 minutos em configurações automáticas (30 seg em 30 seg off à potência máxima). </li><li> Remover 800 ng (40 L) de produto sonicado e colocar em tubo de centrífuga siliconizado 1,7 ml para a imunoprecipitação (IP) da reação. </li><li> Retiradas restantes ng 200 (10 ml) para servir como entrada (IN) de ADN de referência (loja a 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON de DNA metilado <ol><li> Desnaturar o DNA que será usado para a reação IP (800 ng) a 95 ° C por 10 minutos em banho-maria. </li><li> Arrefecer imediatamente no gelo. Deixe esfriar completamente DNA (aproximadamente 5 minutos no gelo) antes de prosseguir com o próximo passo. </li><li> Adicionar 5 mg de anticorpos monoclonais. </li><li> Adicionar tampão IP (usado em temperatura ambiente durante todo este protocolo) para um volume final de 500 mL. </li><li> Incubar por 2 horas a 4 ° C na rotação titular tubo. </li><li> Pouco antes de o passo 5 está completa, prepare Dynabeads por lavagem (Passos 6-11). Em primeiro lugar, voltar a suspender as contas completamente dentro do frasco em vortex. </li><li> Transferência de 30 mL (~ 2 x 10 7) de Dynabeads ressuspenso por reação mais 1, em um novo tubo siliconizado (por exemplo, se fazendo 8 reações, remova contas suficiente para 9, ou seja, 270 mL). </li><li> Colocar o tubo na cremalheira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Pipeta fora do sobrenadante. Quando retirar o sobrenadante, evite tocar os grânulos contra a parede interna (onde as contas atrair para o ímã) com a ponta da pipeta. </li><li> Remova o tubo do ímã, e ressuspender as contas em um excesso de volume de tampão IP (750 mL mL-1000). Colocar o tubo de volta na prateleira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Repita o lava mais uma vez, e depois voltar a suspender as contas lavados em tampão IP no volume original removidos na Etapa 7. </li><li> Adicionar 30 mL de Dynabeads lavada para cada reação IP </li><li> Incubar em um suporte de tubo rotativo durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Após a incubação estiver concluída, coloque o tubo na cremalheira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Pipeta fora do sobrenadante. Evite tocar a parede interior do tubo (onde as contas atrair para o ímã) com a ponta da pipeta. Adicionar 500 mL de tampão IP. Misture o conteúdo do tubo e colocá-lo de volta na prateleira magnética por 2 minutos. Repita lave com 500 ul de buffer IP uma só vez. </li><li> Após a remoção do sobrenadante da última lavagem, ressuspender as contas em 400 mL de tampão de digestão. </li><li> Tratar a reação com 100 mg de Proteinase K e incubar durante a 50 ° C. </li></ol> PURIFICAÇÃO DE DNA IMMUNOPRECIPITATED <ol><li> Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e vortex completamente. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Repita as etapas 1 a 3 se a interfase entre as camadas aquosa e orgânica parece nublado. </li><li> Adicione 1 / 10 º volume 3 M acetato de sódio (40 mL) e vortex. </li><li> Adicionar 1 ml de glicogênio (20 mcg / mL) e vortex. </li><li> Adicionar 2 volumes (1000 L) de etanol 100%, vortex, e coloque a -20 ° C por 20 minutos. </li><li> Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol, spin pulso, e remover o etanol residual. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol frio a 70% de lavar. Brevemente Vortex, e giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol 70%, giro de pulso, e remover o etanol residual por pipetagem. </li><li> O ar seco do sedimento com a tampa aberta por 10 minutos em temperatura ambiente para remover todos os vestígios do etanol residual. </li><li> Ressuspender DNA sedimento em 10 ml esterilizados dH 2 0. </li></ol> Validação por PCR <ol><li> Você pode testar para garantir que o seu procedimento MEDIP está funcionando, a execução do protocolo MEDIP usando DNA humano normal (masculino ou feminino) e, posteriormente, assaying uma região conhecida por ser enriquecido para metilação. </li><li> Remover 30% do produto MEDIP ao tubo de PCR, e outros 30% do produto MEDIP para outro tubo de PCR. </li><li> Colocar 10 ng de DNA IN em um tubo de PCR, e 10 ng de DNA IN em outro tubo de PCR. Você deve ter agora quatro reações distintas PCR para configurar. </li><li> Realizar PCR usando primers H19 e CTRL como indicado na Tabela 1. </li><li> Prepare duas mastermixes (um para cada conjunto de primers) para reações de PCR com 12,5 mL de volume total, como descrito na Tabela 2. </li><li> Thermocycle do PCR usando as condições descritas na Tabela 3. </li><li> Correr 5 mL de produtos de PCR em um gel de agarose 2% para visualização. </li><li> Os resultados esperados para MEDIP sucesso são apresentados na Tabela 4. </li></ol> Tabelas Tabela 1: H19 e CTRL primers para a validação de PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Definir Primer </td><td> Primer para a frente </td><td> Primer reverso </td><td> Tamanho do produto antecipado </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (controle) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Mastermixes para as reações PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (por Rxn) </td><td> CTRL Mix (por Rxn) </td></tr><tr><td&gt; 2 O DDH </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> Tampão 10X </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mM cada) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Primers (H19_F / R ou CTRL_F / R) (10 mM cada F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Taq Platinum </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Condições de PCR thermocyling. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Resultados esperados para o MEDIP PCR bem sucedido. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> DNA modelo </td></tr><tr><td> Primer usados </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positivo </td><td> Positivo </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positivo </td><td> Negativo </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
<li>Feinberg, A. P., Tycko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+cancer+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">The history of cancer epigenetics.</a> Nature reviews. 4, 143-153 (2004).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Há uma consciência crescente do papel significativo desempenha na doença de metilação do DNA, portanto, o desenvolvimento de ensaios para medir esta modificação estão se tornando cada vez mais importante 3, 12, 13. A técnica MEDIP é um instrumento favorável para triagem, tanto do genoma inteiro-o e locus específico de nível 6, 7. Esta técnica oferece uma visão rápida dos níveis de metilação do DNA usando quantidades limitadas de partida DNA e permite comparações fáceis entre diferentes fontes. Apli...

<table><tbody><tr><td>Sonicador Biorupter</td><td>Ferramenta</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga SafeSeal de 1,7 ml</td><td>Outro</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>Espetrofotômetro ND 3300</td><td>Ferramenta</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Primário: Anti-5&amp;rsquo;-metilcitosina mouse mAb</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário: Dynabeads M-280 Ovelha anti-mouse IgG</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Grade Magnética para Tubos</td><td>Ferramenta</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Ferramenta</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de IP</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Armazenado à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tampão de Digestão</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

imunoprecipitação dna metilado

Methylated DNA Immunoprecipitation

A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, como a metilação é conhecido por ter efeitos significativos sobre a expressão gênica, e está envolvida com desenvolvimento normal, bem como doença<sup&gt; 04/01</sup&gt;. Assim, a capacidade de discriminar entre o DNA metilado e não metilado-DNA é essencial para a geração de perfis de metilação para esses estudos. Metilado DNA imunoprecipitação (MEDIP) é uma técnica eficiente para a extração de DNA metilado partir de uma amostra de interesse<sup&gt; 07/05</sup&gt;. Uma amostra de tão pouco como 200 ng de DNA é suficiente para o anticorpo, ou imunoprecipitação (IP), a reação. DNA é sonicado em fragmentos que variam em tamanho de 300-1000 pb, e está dividido em immunoprecipitated (IP) e de entrada (IN) parcelas. DNA IP é posteriormente calor desnaturado e, em seguida, incubadas com anti-5&#39;mC, permitindo que o anticorpo monoclonal de se ligar DNA metilado. Após isso, esferas magnéticas contendo um anticorpo secundário com afinidade para o anticorpo primário são adicionados e incubados. Estes anticorpos bead-linked ligará o anticorpo monoclonal utilizado na primeira etapa. DNA ligado ao complexo de anticorpos (DNA metilado) é separado do resto do DNA usando um ímã para puxar os complexos de solução. Várias lavagens com tampão IP são, então, realizada para remover o desacoplado, DNA não-metilado. O DNA metilado / anticorpo complexos são então digeridos com proteinase K para digerir os anticorpos, deixando apenas o DNA metilado intacta. O DNA enriquecido é purificado por fenol: clorofórmio extração para remover a matéria de proteínas e, em seguida, precipitado e ressuspenso em água para uso posterior. Técnicas de PCR pode ser usado para validar a eficiência do procedimento MEDIP pela análise dos produtos de amplificação de IP e no DNA das regiões conhecidas por falta e conhecido por conter seqüências metiladas. O DNA purificado metilado pode então ser usada para o locus-específica (PCR) ou genome-wide (microarray e seqüenciamento) Estudos de metilação, e é particularmente útil quando aplicado em conjunto com outras ferramentas de pesquisa, tais como perfil de expressão gênica e hibridização genômica comparativa de matriz ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Uma investigação mais aprofundada para metilação do DNA levará à descoberta de novos alvos epigenéticos, que por sua vez, pode ser útil no desenvolvimento de novas ferramentas de pesquisa terapêutica ou prognóstico para doenças como o câncer que se caracterizam por DNA metilado aberrantemente<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).

Imunoprecipitação DNA metilado

A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, visto que se sabe que a metilação exerce efeitos significativos sobre...

Este vídeo demonstra um protocolo para imunoprecipitação de DNA metilado ou meetup. Um método utilizado para isolar especificamente DNA metilado de maneira imparcial. A metilação de DNA em mamíferos é caracterizada pela adição de um grupo metila à posição C5 da citosina.Quando presente em um dinucleotídeo CPG, trata-se de uma marca epigenética reversível que desempenha um papel importante no desenvolvimento normal, bem como em diversos processos de doenças. As funções normais da metilação do DNA incluem a inativação do cromossomo X em fêmeas, o silenciamento de elementos repetitivos, a impressão genômica e a manutenção da estabilidade genômica. A metilação do DNA também demonstrou desempenhar um papel em inúmeras doenças, como câncer, síndrome de Prader-Willi, síndrome de ICF (imunodeficiência, instabilidade centromérica e anomalias faciais) e síndrome de Rett.Em cânceres, por exemplo, a hipermetilação anormal e os promotores podem resultar no silenciamento de genes vitais supressores de tumor. Enquanto a hipometilação inadequada resulta em instabilidade cromossômica e ativação de oncogenes, a reunião é realizada primeiramente pela sonicação do DNA em fragmentos com tamanhos variando de 300 a 1000 pares de bases. O DNA sonicado é então desnaturado a 95 graus Celsius.Acrescentam-se anticorpos primários, que reconhecem a pentametazina, e permite-se que se liguem a fragmentos de DNA metilado. Anticorpos secundários, conjugados a microesferas magnéticas Dyna, são utilizados para isolar fragmentos de DNA que foram ligados pelo anticorpo primário. Os fragmentos não metilados são removidos e os anticorpos são digeridos pela proteinase.A limpeza com fenil cloroformo KA remove a proteína digerida e a precipitação purifica o DNA, que agora está enriquecido em fragmentos metilados. O DNA pode ser usado em aplicações como PCR, microarranjo e sequenciamento. O procedimento é geralmente realizado em dois dias.O dia um envolve a preparação do DNA, sonicação, imunoprecipitação e digestão proteica. O dia dois envolve extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol para purificar e isolar o DNA enriquecido para metilação. Existem alguns materiais especiais necessários para o procedimento, incluindo tubos de centrífuga silanizados, um dispositivo de sonicação de DNA, anticorpo primário, anticorpo monoclonal anti-5-metilcitosina de camundongo, anticorpo secundário, beads Dyna conjugados com anticorpo de ovelha anti-IgG de camundongo e um suporte magnético para tubos.O primeiro passo no protocolo Meetup é o preparo do DNA. É fundamental avaliar a natureza do DNA previamente. Conhecer o estado do DNA da amostra, se é predominantemente de fita dupla ou fita simples, é necessário, pois a quantificação precisa da amostra é de extrema importância, e diversos métodos de determinação da quantidade de DNA podem ser negativamente afetados pela presença de espécies indesejadas de DNA.A quantidade de DNA de dupla fita pode ser avaliada facilmente por fotometria espectral utilizando um NanoDrop 3, 300 nd carregue 1,5 microlitros e defina o tipo de medição como ácido nucleico, selecione DNA 50 como o cálculo e inicialize o instrumento com 1,5 microlitros de água. Limpe os pedestais e faça a leitura de branco com 1,5 microlitros do líquido. A amostra é dissolvida em limpe os pedestais, carregue 1,5 microlitros da amostra e pressione medir.A concentração será fornecida e pode ser utilizada. Para calcular o número de microlitros necessários para mim, mergulhe um A dois 60 a dois 80 com uma razão de 1,8, o que é ideal aqui. Uma amostra de um micrograma é preparada.No entanto, uma amostra de apenas 200 nanogramas é suficiente para obter resultados bem-sucedidos. Para reunião, carregue a amostra de DNA em um tubo limpo silanizado. Adicione água estéril suficiente para atingir um volume final de 50 microlitros.A sonicação do DNA e a imunoprecipitação devem ser realizadas em tubos silanizados para evitar a ligação inespecífica de DNA e proteínas às paredes dos tubos. Uma vez que o DNA tenha sido preparado, a amostra deve ser sonicada; a sonicação é necessária para fragmentar o DNA, pois a imunoprecipitação é mais eficiente com fragmentos menores de DNA. Carregue a amostra no sonicador, certifique-se de que a configuração de potência esteja no nível alto e de que a máquina esteja programada para 30 segundos. Após 30 segundos desligados, encha a base até a linha de marcação com água a quatro graus Celsius.Sonicar a amostra por sete minutos. Quando a sonicação terminar, retire o tubo e coloque-o em gelo. É importante otimizar as condições de sonicação para o seu tamanho de DNA e amostra previsto previamente.Por exemplo, uma amostra de DNA parcialmente degradada exigirá um tempo de sonicação mais curto. Os produtos da sonicação podem ser visualizados por técnicas eletroforéticas padrão. Neste momento, são desejados fragmentos de DNA com tamanho variando de 300 a 1000 pares de bases para uso posterior.Nos ensaios de microarranjo e PCR, você deve reservar um quinto do seu DNA para servir como DNA de entrada ou de referência; neste caso, 800 nanogramas de DNA sonicado serão utilizados para a imunoprecipitação e o restante será reservado como DNA de referência. O próximo passo no protocolo é a reação de imunoprecipitação (IP); antes da adição do anticorpo primário, o DNA deve ser desnaturado. A desnaturação é necessária porque o anticorpo primário é sensível ao DNA de fita simples.Coloque a amostra em banho-maria a 95 graus Celsius por 10 minutos. Quando a etapa de desnaturação estiver concluída, transfira imediatamente o tubo para gelo por pelo menos cinco minutos. Isso impedirá que o DNA desnaturado se reanilhe e permitirá uma ligação ideal do anticorpo quando a amostra tiver esfriado.Gire o tubo brevemente para recolher o conteúdo no fundo. Em seguida, deve-se adicionar o anticorpo primário. A quantidade de anticorpo utilizada deve ser titulada para cada lote e para cada fabricante.Neste caso, adicionamos cinco microgramas de anticorpo primário e, em seguida, adicionamos tampão de imunoprecipitação ou tampão IP até um volume final de 500 microlitros. Em seguida, o DNA de IP é colocado em um rotador e deixado em incubação a quatro graus Celsius por duas horas. A rotação é necessária para evitar a conglobação do anticorpo dentro do tubo durante a incubação.Aproximadamente 15 minutos antes de concluir a incubação com o anticorpo primário, limpe e prepare as microesferas magnéticas Dyna. Primeiro, ressuspenda completamente as microesferas no frasco por vortexamento. Em seguida, transfira 30 microlitros de microesferas para um tubo limpo silanizado e coloque esse tubo em um suporte magnético para múltiplas reações.Transfira 30 microlitros de microesferas por reação, mais o suficiente para uma reação adicional para compensar erros de pipetagem ou perda inadvertida de algumas microesferas. Por exemplo, para oito reações, remova microesferas suficientes para nove reações ou 270 microlitros.As microesferas magnéticas serão atraídas para a parede do suporte magnético. Aguarde dois minutos para que as microesferas migrem e se acomodem em uma faixa definida na parede do tubo. Em seguida, remova e descarte o sobrenadante com cuidado usando uma pipeta, certificando-se de evitar perturbar as microesferas na parede traseira com a ponteira da pipeta.Substitua o sobrenadante por um volume em excesso de tampão de IP, agite em vórtex e coloque-o novamente no suporte magnético por dois minutos. Repita essa lavagem mais uma vez e re-suspenda as perlas lavadas em seu volume original de tampão de IP. Retire o tubo de amostra do rotator quando a incubação estiver concluída.Para concluir a imunoprecipitação, adicione 30 microlitros de microesferas limpas à reação e coloque o tubo de volta no rotador por duas horas a quatro graus Celsius. Durante esta incubação, o anticorpo secundário, que é anti-IgG de camundongo, se ligará ao anticorpo primário de camundongo. Os anticorpos anti-camundongo estão conjugados a microesferas magnéticas Dyna, permitindo a fácil recuperação dos produtos ligados e a etapa de purificação subsequente.Após a conclusão da incubação com ambos os anticorpos, coloque o tubo de IP no suporte magnético por dois minutos. Neste momento, o DNA metilado estará ligado ao anticorpo primário, que por sua vez estará ligado ao anticorpo secundário conjugado às microesferas magnéticas (dyna beads). Remova e descarte o sobrenadante e substitua por 500 microlitros de tampão de IP.Misture o conteúdo do tubo e coloque-o novamente no suporte por dois minutos. Repita essa lavagem com o tampão IP mais uma vez. Após a remoção do sobrenadante da última lavagem Resus, suspenda as microesferas pela última vez.Em 400 microlitros de Tampão de digestão, trate a reação com 100 microgramas de proteinase K e incube durante a noite a 50 graus Celsius. O tratamento com proteinase K é necessário para digerir as proteínas do anticorpo e quaisquer proteínas residuais associadas ao DNA, permitindo que o DNA metilado seja liberado em solução. A purificação de DNA é realizada no segundo dia do procedimento de encontro; retire o tubo de digestão do incubador.Em uma capela de exaustão, adicione 500 microlitros de fenol-clorofórmio na proporção um para um, com pH sete, ao tubo e homogeneíze completamente por vortex. Centrifugue o tubo por 10 minutos a 13.000 ×g. Remova cuidadosamente a fase aquosa superior do tubo sem perturbar a interface ou retirar qualquer parte da camada orgânica. Transfira a fase aquosa para um novo tubo.Pode-se realizar uma segunda extração se a interface apresentar aspecto turvo. Em seguida, adicione um décimo do volume de acetato de sódio três molar; neste caso, 40 microlitros. Um microlitro de glicogênio pode ser usado como carreador para facilitar a limpeza do pellet.Vortexe o tubo para misturar o conteúdo. Em seguida, adicione dois volumes de etanol a 100%, vortexe e congele em freezer a menos 20 graus Celsius por 20 minutos após o congelamento. O DNA precipitado é centrifugado em centrífuga a 13.000 ×g e 4 graus Celsius por 20 minutos.Um pellet de DNA será formado no fundo do tubo. Retire o tubo da centrífuga e remova o etanol. Tenha cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo.Pode ser necessário um centrifugamento breve para remover qualquer etanol residual. Para lavar o pellet, adicione 500 microlitros de etanol a 70% frio, vortexie e centrifugue novamente por 20 minutos a 13.000 ×g e 4 °C. Quando a segunda centrifugação estiver concluída, remova o etanol a 70% com um centrifugamento breve e retire o etanol residual com uma pipeta.Deixe o tubo em um suporte com a tampa aberta para secar o pellet e permitir que o etanol remanescente evapore. Por fim, re-suspenda o pellet contendo apenas DNA enriquecido para metilação em 10 microlitros de água estéril, permitindo tempo suficiente para que o pellet de DNA se dissolva antes do uso. É uma boa prática validar a eficiência do enriquecimento por PCR.Isso pode ser feito realizando reações de PCR projetadas para amplificar produtos que ilustrem diferencialmente fragmentos de DNA metilados e não metilados com primers de DNA humano normal. A região de controle de impressão H19 pode ser usada em conjunto com primers projetados para amplificar uma região do genoma que não é metilada. Sequências de exemplos de primers e condições de ciclagem de PCR podem ser encontradas no protocolo anexo.Neste ponto, é necessário recuperar o DNA de entrada ou de referência que foi reservado no início do protocolo de meetup. Um conjunto de reações de PCR será montado utilizando o DNA de entrada, e o outro conjunto utilizará o DNA de IP enriquecido para metilação. Se o meetup foi bem-sucedido, a PCR de IP produzirá um produto utilizando os primers de metilação e nenhum produto utilizando os primers controle.Por outro lado, a PCR de entrada deve produzir produtos utilizando ambos os primers, pois contém fragmentos metilados e não metilados. Fragmentos de DNA. O DNA enriquecido por fragmentos metilados pode ser usado para diversas aplicações posteriores, como sequenciamento por PCR e análise por microarranjo.Quando integrada a outras técnicas de biologia molecular, pode ser utilizada para investigar o status de metilação do DNA de forma específica para um locus ou abrangente ao genoma, para perfis de metilação ou estudos de Epigenômica.

Research

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Biology

Biologia

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