Imunoprecipitação DNA metilado

Este vídeo demonstra um protocolo para imunoprecipitação ou encontro de DNA metilado. Um método usado para isolar especificamente o DNA metilado de maneira imparcial. A metilação do DNA em mamíferos é caracterizada pela adição de um grupo metil à posição C cinco da citosina.

Quando presente em um dinucleotídeo CPG, é uma marca epigenética reversível que desempenha um papel importante no desenvolvimento normal, bem como em vários processos patológicos. As funções normais da metilação do DNA incluem inativação do cromossomo X em mulheres, silenciamento repetitivo de elementos, impressão genômica e manutenção da estabilidade genômica. A metilação do DNA também demonstrou desempenhar um papel em várias doenças, como câncer, síndrome de Willi, síndrome de Engelman e imunodeficiência, instabilidade centrífuga e síndrome de anomalia facial.

Nos cânceres, por exemplo, a hipermetilação anormal e os promotores podem resultar no silenciamento de genes supressores de tumor vitais. Embora a hipometilação inadequada resulte em instabilidade cromossômica e ativação de oncogenes, o encontro é realizado pela primeira patinação sônica do DNA em fragmentos que variam em tamanho de 300 a 1000 pares de bases. O DNA sonicado é então desnaturado a 95 graus Celsius.

Anticorpos primários, que reconhecem cinco metazinas primárias, são adicionados e podem se ligar a fragmentos de DNA metilados. Anticorpos secundários, conjugados a esferas magnéticas dyna, são usados para isolar fragmentos de DNA, que foram ligados pelo anticorpo primário. Fragmentos não metilados são removidos e os anticorpos são digeridos pela proteinase.

A limpeza do fenilclorofórmio KA remove a proteína digerida e a precipitação purifica o DNA, que agora é enriquecido para fragmentos metilados. Meetup, o DNA pode ser usado para aplicações como PCR microarray e sequenciamento. O Meetup geralmente é realizado como um procedimento de dois dias.

O primeiro dia envolve preparação de DNA, sonicação, imunoprecipitação e digestão de proteínas. O segundo dia envolve extração de clorofórmio de pH e precipitação de etanol para purificar e isolar o DNA enriquecido para metilação. Existem alguns materiais especiais necessários para o encontro, incluindo tubos de centrífuga siliconizados, um dispositivo de sunação de DNA, anticorpo primário, camundongo anti-metazina de cinco primos, anticorpo monoclonal, anticorpo secundário, grânulos dyna, conjugados a ovelhas, IgG anti-EUA e um rack de tubo magnético.

O primeiro passo no protocolo de encontro é a preparação do DNA. É imperativo avaliar a natureza do DNA de antemão. É necessário conhecer o estado do DNA da amostra, se é principalmente de fita dupla ou simples, pois a quantificação precisa da amostra é de extrema importância e vários métodos de determinação da quantidade de DNA podem ser afetados adversamente pela presença de espécies de DNA indesejadas.

A quantidade de DNA de fita dupla pode ser avaliada facilmente por fotometria espectral usando um NanoDrop 3, 300 nd carga de 1,5 microlitros e definir o tipo de medição para ácido nucléico, selecionar DNA 50 como cálculo e inicializar o instrumento com 1,5 microlitros de água. Limpe os pedestais e cubra o instrumento com 1,5 microlitros do líquido. A amostra é dissolvida em limpar os pedestais, carregar 1,5 microlitros da amostra e atingir a medida.

A concentração será dada e pode ser usada. Para calcular o número de microlitros necessários para mim, mergulhe uma proporção de A dois 60 para dois 80 de 1,8 é ideal aqui. Prepara-se uma amostra de um micrograma.

No entanto, uma amostra de apenas 200 nanogramas é suficiente para obter resultados bem-sucedidos. Para o encontro, carregue a amostra de DNA em um tubo siliconizado limpo. Adicione água estéril suficiente Para trazer o volume final para 50 microlitros.

A sonicação e a imunoprecipitação do DNA devem ser realizadas em tubos siliconizados para evitar a ligação inespecífica de DNA e proteínas às paredes do tubo. Uma vez que o DNA tenha sido preparado, a amostra deve ser sonicação sônica é necessária para fragmentar o DNA, pois a imunoprecipitação é mais eficiente com fragmentos menores de DNA, carregar a amostra no sonicate, garantir que a configuração de potência esteja definida como alta e que a máquina esteja configurada para 30 segundos. Em 30 segundos desligado, encha a base na linha de enchimento com água a quatro graus Celsius.

Sonicate a amostra Por sete minutos. Quando a sonicação terminar, remova o tubo e coloque-o no gelo. É importante otimizar as condições de sonicação para sua amostra prevista, tamanho do DNA de antemão.

Por exemplo, uma amostra de DNA parcialmente degradada exigirá um tempo de sonicação mais curto. Os produtos de sonicação podem ser visualizados por técnicas eletroforéticas padrão. Fragmentos de DNA variando em tamanho de 300 a 1000 pares de bases de comprimento são desejados neste momento para uso posterior.

Em ensaios de microarray e PCR, você deve reservar um quinto do seu DNA para servir como entrada ou DNA de referência, neste caso, 800 nanogramas de DNA sonicado serão usados para a imunoprecipitação e o restante será reservado como DNA de referência. O próximo passo no protocolo de mídia é a imunoprecipitação ou reação IP antes da adição do anticorpo primário, o DNA deve ser desnaturado. A desnaturação é necessária porque o anticorpo primário é sensível ao DNA de fita simples.

Coloque a amostra em banho-maria a 95 graus Celsius por 10 minutos. Quando a etapa de desnaturação estiver concluída, transfira imediatamente o tubo para gelo por pelo menos cinco minutos. Isso impedirá que o DNA de desnaturação de Reen se ajoelhe e permitirá a ligação ideal de anticorpos quando a amostra esfriar.

Gire o tubo brevemente para puxar o conteúdo para o fundo. Em seguida, o anticorpo primário deve ser adicionado. A quantidade de anticorpo utilizada deve ser titulada para cada lote e para cada fabricante.

Nesse caso, adicionamos cinco microgramas de anticorpo primário e, em seguida, adicionamos tampão de imunoprecipitação ou tampão IP a um volume final de 500 microlitros. Em seguida, o DNA IP é colocado em um rotador e deixado para incubar a quatro graus Celsius por duas horas. A rotação é necessária para evitar o conglomerado de anticorpos dentro do tubo durante a incubação.

Cerca de 15 minutos antes da incubação do anticorpo primário estar completa, limpe e prepare as esferas magnéticas dyna. Primeiro, ressuspenda completamente as contas no frasco por vórtice. Em seguida, transfira 30 microlitros de contas para um tubo siliconizado limpo e coloque esse tubo em um rack magnético para várias reações.

Transfira 30 microlitros de grânulos por reação, mais o suficiente para uma reação adicional para permitir erro de pipetagem ou perda inadvertida de alguns grânulos. Por exemplo, para oito reações. Remova contas suficientes para nove reações ou 270 microlitros.

As contas magnéticas serão puxadas em direção à parede do rack magnético. Aguarde dois minutos para que as contas migrem e se estabeleçam em uma faixa definida na parede do tubo. Em seguida, remova e descarte a pipeta sobrenadante com cuidado, certificando-se de evitar perturbar os grânulos na parede traseira com a ponta da pipeta.

Substitua o sobrenadante por um volume excessivo de vórtice de buffer IP e coloque-o de volta no rack magnético por dois minutos. Repita esta lavagem mais uma vez e ressuspenda as contas de lavagem em seu volume original de buffer IP. Recupere o sample tubo do Rotator quando a incubação terminar.

Para completar a imunoprecipitação, adicione 30 microlitros de grânulos limpos à reação e coloque o tubo de volta em um rotador por duas horas a quatro graus Celsius. Durante esta incubação, o anticorpo secundário, que é anti IgG de camundongo, se ligará ao anticorpo primário de camundongo. Os anticorpos anti-camundongo são conjugados a esferas magnéticas dyna, permitindo fácil recuperação dos produtos ligados e a etapa de purificação a seguir.

Quando a incubação com ambos os anticorpos estiver concluída, coloque o tubo IP no rack magnético por dois minutos. Neste ponto, o DNA metilado será ligado pelo anticorpo primário, que por sua vez será ligado pelo anticorpo secundário conjugado com grânulos dyna. Remova e descarte o sobrenadante e substitua-o por 500 microlitros de tampão IP.

Misture o conteúdo do tubo e coloque-o de volta na grelha por dois minutos. Repita essa lavagem com buffer IP mais uma vez. Depois de remover o sobrenadante da última lavagem Resus, suspenda as contas pela última vez.

Em 400 microlitros de tampão de digestão, trate a reação com 100 microgramas de proteinase K e incube durante a noite a 50 graus Celsius. O tratamento com proteinase K é necessário para digerir as proteínas do anticorpo e qualquer proteína residual associada ao DNA, permitindo que o DNA metilado seja liberado em solução. A purificação do DNA é realizada no segundo dia do procedimento de encontro, recupere o tubo de digestão da incubadora.

Em uma capela de exaustão, adicione 500 microlitros de fenoclorofórmio um a um a pH sete ao tubo e vorte completamente Gire o tubo por 10 minutos a 13.000. G. Remova cuidadosamente a fase aquosa superior do tubo sem perturbar a interface ou remover qualquer camada orgânica. Transferir a fase aquosa para um novo tubo.

Uma segunda extração pode ser feita se a interface aparecer nublada. Em seguida, adicione um 10º volume de acetato de sódio de três molares, neste caso, 40 microlitros. Um microlitro de glicogênio pode ser usado como transportador para facilitar a limpeza dos pellets.

Vortex o tubo para misturar o conteúdo. Em seguida, adicione dois volumes de etanol 100%, vórtice e congele em um freezer de menos 20 graus Celsius por 20 minutos após o congelamento. O DNA precipitado é girado em uma centrífuga a 13.000 G e quatro graus Celsius por 20 minutos.

Um pellet de DNA se formará no fundo do tubo. Recupere o tubo da centrífuga e remova o etanol. Tenha cuidado para não perturbar o pellet no fundo do tubo.

Um giro de pulso pode ser necessário para remover qualquer etanol residual. Para lavar o pellet, Adicione 500 microlitros de frio, vórtice de etanol 70% e gire novamente por 20 minutos a 13.000 G e quatro graus Celsius. Quando a segunda centrifugação estiver concluída, remova a centrifugação do pulso de etanol a 70% e remova o etanol residual com uma pipeta.

Deixe o tubo em uma prateleira com a tampa aberta para secar o pellet e permitir que o etanol restante evapore. Finalmente, Reus suspende o pellet contendo apenas DNA enriquecido para metilação e 10 microlitros de água estéril, permitindo tempo suficiente para que o pellet de DNA se dissolva antes do uso. É uma boa prática validar a proficiência do meetup por PCR.

Isso pode ser feito executando reações de PCR projetadas para amplificar produtos que ilustram fragmentos de DNA metilados e não metilados diferencialmente para amplificação de primers de DNA humano normal. A região de controle de imprinting H 19 pode ser usada em conjunto com primers projetados para amplificar uma região do genoma que não é metilada. Por exemplo, sequências de primers e condições de ciclagem de PCR podem ser encontradas no protocolo anexo.

Neste ponto, é necessário recuperar o DNA de entrada ou referência que foi reservado no início do protocolo de encontro. Um conjunto de reações de PCR será configurado usando o DNA de entrada e o outro conjunto usará o DNA IP enriquecido para metilação. Se o encontro for bem-sucedido, o IP PCR produzirá um produto usando os primers de metilação e nenhum produto usando os primers de controle.

Por outro lado, a PCR de entrada deve produzir produtos usando ambos os primers, pois contém metilado e não metilado. Fragmentos de DNA. O DNA enriquecido para fragmentos metilados pode ser usado para várias aplicações a jusante, como sequenciamento de PCR e análise de microarray.

Quando integrado com outras técnicas de biologia molecular, pode ser usado para investigar o estado de metilação do DNA em um locus específico ou de maneira ampla do genoma para perfil de metilação ou estudo de epigenômica.