Name: Imunoprecipitação DNA metilado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 24 s
Description: Aprenda a técnica de imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP) para isolar fragmentos de DNA metilado de forma não enviesada. Este método é essencial para estudos de epigenética e investigação de mecanismos de doenças como o câncer.

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Queremos agradecer aos membros do Brown e laboratórios Lam pela sua participação na crítica a este vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research eo Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde.

EXTRAÇÃO DE DNA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DNA de uma variedade de diferentes amostras (células cultivadas fresca, congelada, bem como tecidos fixados em formalina incluído em parafina) podem ser usados ​​para MEDIP. É importante o uso de DNA altamente purificado, sem proteínas associadas, tais como histonas. Também é importante para remover RNA, tanto quanto possível a partir da amostra, como ele pode interferir tanto com a quantificação de DNA e ligação aos anticorpos. A quantidade de DNA usado para MEDIP pode variar de 200 ng de 1 mg, dependendo da quantidade de DNA disponíveis. Para demonstrar este protocolo, 1 mg de DNA será usado. O seguinte protocolo irá proporcionar alta qualidade do DNA fita dupla a partir de células cultivadas. Outros protocolos devem ser empregados para a extração de DNA de tipos de amostra outro. <ol><li> Adicionar 400 mL de tampão de digestão para um pellet de células em um tubo Eppendorf 1,7 ml. </li><li> Adicionar 100 mg de proteinase K para o tubo e incubar durante a 50 ° C. </li><li> Adicionar 500 mL de fenol pH 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Repita as etapas 3 a 5 uma vez. </li><li> Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Adicionar 40 mg de RNase A e incubar 1 hora a 37 ° C. </li><li> Adicionar 500 mL de fenol pH 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Repita as etapas 11 a 13 uma vez. </li><li> Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e misturar suave mas completamente por inversão. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Adicionar volume 1/10th 3 M acetato de sódio (40 mL) e misture bem. </li><li> Adicionar 2 volumes (900 L) de etanol 100%, misture bem e coloque a -20 ° C por 20 minutos. </li><li> Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol, spin pulso, e remover o etanol residual. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol frio a 70% de lavar. Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol 70%, giro de pulso, e remover o etanol residual por pipetagem. </li><li> O ar seco do sedimento com a tampa aberta por 10 minutos em temperatura ambiente para remover todos os vestígios do etanol residual. </li><li> Ressuspender o DNA em 50 ul de dH2O esterilizado durante a noite a 4 ° C. </li><li> Quantificar o DNA utilizando um Espectrofotômetro NanoDrop. Um A 260: Uma relação de 280 de 1.8 é ideal. </li><li> Determinar a qualidade do DNA e faixa de tamanho em um gel de agarose com 100 bp ladder. Tão pouco como 10 ng de DNA genômico pode ser executado em um gel de agarose 1,7% seguido de coloração com um corante que é altamente sensível a pequenas quantidades de DNA, tais como ouro SYBR. </li><li> Em um tubo siliconizado por amostra, prepare 1 mg de DNA em um volume total de 50 l com o restante do volume composto esterilizado com dH 2 O. </li></ol> DNA sonicação DNA sonicação eo protocolo MEDIP deve ser realizada em tubos siliconzied para evitar a ligação específica de proteínas não às paredes do tubo. Vezes sonicação ideal para as amostras de DNA são baseados no grau de fragmentação da amostra de DNA determinado a partir de eletroforese em gel (Passo 27). Por exemplo, o DNA extraído de células em cultura deve ser de muito alto peso molecular, e, posteriormente, exigir mais do que sonicação DNA extraído de amostras de arquivo que são muitas vezes parcialmente degradada. Se as amostras são de uniformemente elevado peso molecular, é razoável neste momento a proceder à sonicação, conforme descrito neste protocolo sem verificar cada amostra individualmente. Se as amostras são fragmentados com amostras de arquivo, será necessário adaptar o procedimento de sonicação provavelmente por diminuir os tempos de sonicação para obter 300-100bp fragmentos. Se você esperar para processar as amostras que são parcialmente degradadas, otimização de parâmetros de sonicação pode ser realizada em uma amostra representativa daqueles de interesse. Com base no grau de fragmentação do DNA observados de eletroforese em gel (Passo 27), o experimentador pode predeterminar o tempo de sonicação ideal para a amostra. Aqui nós descrevemos um método para obter 300-1000 fragmentos de DNA bp por sonicação com um dispositivo automatizado sonicando (Bioruptor de Diagenode, UCD-200 TM) usando DNA de alto peso molecular. <ol><li> Água em Biorupter deve ser a 4 ° C. </li><li> Sonicate por 7 minutos em configurações automáticas (30 seg em 30 seg off à potência máxima). </li><li> Remover 800 ng (40 L) de produto sonicado e colocar em tubo de centrífuga siliconizado 1,7 ml para a imunoprecipitação (IP) da reação. </li><li> Retiradas restantes ng 200 (10 ml) para servir como entrada (IN) de ADN de referência (loja a 4 ° C). </li&gt; </ol> IMMUNOPRECIPITATON de DNA metilado <ol><li> Desnaturar o DNA que será usado para a reação IP (800 ng) a 95 ° C por 10 minutos em banho-maria. </li><li> Arrefecer imediatamente no gelo. Deixe esfriar completamente DNA (aproximadamente 5 minutos no gelo) antes de prosseguir com o próximo passo. </li><li> Adicionar 5 mg de anticorpos monoclonais. </li><li> Adicionar tampão IP (usado em temperatura ambiente durante todo este protocolo) para um volume final de 500 mL. </li><li> Incubar por 2 horas a 4 ° C na rotação titular tubo. </li><li> Pouco antes de o passo 5 está completa, prepare Dynabeads por lavagem (Passos 6-11). Em primeiro lugar, voltar a suspender as contas completamente dentro do frasco em vortex. </li><li> Transferência de 30 mL (~ 2 x 10 7) de Dynabeads ressuspenso por reação mais 1, em um novo tubo siliconizado (por exemplo, se fazendo 8 reações, remova contas suficiente para 9, ou seja, 270 mL). </li><li> Colocar o tubo na cremalheira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Pipeta fora do sobrenadante. Quando retirar o sobrenadante, evite tocar os grânulos contra a parede interna (onde as contas atrair para o ímã) com a ponta da pipeta. </li><li> Remova o tubo do ímã, e ressuspender as contas em um excesso de volume de tampão IP (750 mL mL-1000). Colocar o tubo de volta na prateleira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Repita o lava mais uma vez, e depois voltar a suspender as contas lavados em tampão IP no volume original removidos na Etapa 7. </li><li> Adicionar 30 mL de Dynabeads lavada para cada reação IP </li><li> Incubar em um suporte de tubo rotativo durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Após a incubação estiver concluída, coloque o tubo na cremalheira magnética por 2 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Pipeta fora do sobrenadante. Evite tocar a parede interior do tubo (onde as contas atrair para o ímã) com a ponta da pipeta. Adicionar 500 mL de tampão IP. Misture o conteúdo do tubo e colocá-lo de volta na prateleira magnética por 2 minutos. Repita lave com 500 ul de buffer IP uma só vez. </li><li> Após a remoção do sobrenadante da última lavagem, ressuspender as contas em 400 mL de tampão de digestão. </li><li> Tratar a reação com 100 mg de Proteinase K e incubar durante a 50 ° C. </li></ol> PURIFICAÇÃO DE DNA IMMUNOPRECIPITATED <ol><li> Adicionar 500 mL pH 01:01 fenol / clorofórmio 7 e vortex completamente. </li><li> Giram a 13 000 g durante 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Remover fração (em cima) aquosa para um novo tubo. </li><li> Repita as etapas 1 a 3 se a interfase entre as camadas aquosa e orgânica parece nublado. </li><li> Adicione 1 / 10 º volume 3 M acetato de sódio (40 mL) e vortex. </li><li> Adicionar 1 ml de glicogênio (20 mcg / mL) e vortex. </li><li> Adicionar 2 volumes (1000 L) de etanol 100%, vortex, e coloque a -20 ° C por 20 minutos. </li><li> Giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol, spin pulso, e remover o etanol residual. </li><li> Adicionar 500 mL de etanol frio a 70% de lavar. Brevemente Vortex, e giram a 13 000 g durante 20 minutos a 4 ° C. </li><li> Remover o etanol 70%, giro de pulso, e remover o etanol residual por pipetagem. </li><li> O ar seco do sedimento com a tampa aberta por 10 minutos em temperatura ambiente para remover todos os vestígios do etanol residual. </li><li> Ressuspender DNA sedimento em 10 ml esterilizados dH 2 0. </li></ol> Validação por PCR <ol><li> Você pode testar para garantir que o seu procedimento MEDIP está funcionando, a execução do protocolo MEDIP usando DNA humano normal (masculino ou feminino) e, posteriormente, assaying uma região conhecida por ser enriquecido para metilação. </li><li> Remover 30% do produto MEDIP ao tubo de PCR, e outros 30% do produto MEDIP para outro tubo de PCR. </li><li> Colocar 10 ng de DNA IN em um tubo de PCR, e 10 ng de DNA IN em outro tubo de PCR. Você deve ter agora quatro reações distintas PCR para configurar. </li><li> Realizar PCR usando primers H19 e CTRL como indicado na Tabela 1. </li><li> Prepare duas mastermixes (um para cada conjunto de primers) para reações de PCR com 12,5 mL de volume total, como descrito na Tabela 2. </li><li> Thermocycle do PCR usando as condições descritas na Tabela 3. </li><li> Correr 5 mL de produtos de PCR em um gel de agarose 2% para visualização. </li><li> Os resultados esperados para MEDIP sucesso são apresentados na Tabela 4. </li></ol> Tabelas Tabela 1: H19 e CTRL primers para a validação de PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Definir Primer </td><td> Primer para a frente </td><td> Primer reverso </td><td> Tamanho do produto antecipado </td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39;-cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39;-ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 bp </td></tr><tr><td> CTRL (controle) </td><td> CTRL_F5&#39;-gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39;-gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 bp </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Mastermixes para as reações PCR. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19 Mix (por Rxn) </td><td> CTRL Mix (por Rxn) </td></tr><tr><td&gt; 2 O DDH </td><td> 6,875 </td><td> 6,875 </td></tr><tr><td> Tampão 10X </td><td> 1,25 </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> dNTP mix (10 mM cada) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (50 mM) </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Primers (H19_F / R ou CTRL_F / R) (10 mM cada F / R) </td><td> 0,625 </td><td> 0,625 </td></tr><tr><td> Taq Platinum </td><td> 0,25 </td><td> 0,25 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Condições de PCR thermocyling. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95 ° C </td><td> 05:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X </td><td> 95 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 56 ° C </td><td> 00:30 </td></tr><tr><td> 72 ° C </td><td> 00:15 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Resultados esperados para o MEDIP PCR bem sucedido. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center"> DNA modelo </td></tr><tr><td> Primer usados </td><td> IN </td><td> IP </td></tr><tr><td> H19 </td><td> Positivo </td><td> Positivo </td></tr><tr><td> CTRL </td><td> Positivo </td><td> Negativo </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methylome%3A+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends Genet. 24, 231-237 (2008).</li>
<li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%2C+disease%2C+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+research+reviews%22%5BJournal%5D)">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> Ageing research reviews. 5, 449-467 (2006).</li>
<li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> Development. 134, 3959-3965 (2007).</li>
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<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution%2C+silencing+potential+and+evolutionary+impact+of+promoter+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome.</a> Nat Genet. 39, 457-466 (2007).</li>
<li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome-wide+and+promoter-specific+analyses+identify+sites+of+differential+DNA+methylation+in+normal+and+transformed+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells.</a> Nat Genet. 37, 853-862 (2005).</li>
<li>Wilson, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomics%3A+mapping+the+methylome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Epigenomics: mapping the methylome.</a> Cell Cycle. 5, 155-158 (2006).</li>
<li>Gazin, C., Wajapeyee, N., Gobeil, S., Virbasius, C. M., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elaborate+pathway+required+for+Ras-mediated+epigenetic+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An elaborate pathway required for Ras-mediated epigenetic silencing.</a> Nature. 449, 1073-1077 (2007).</li>
<li>Karpinski, P., Sasiadek, M. M., Blin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epigenetic+patterns+in+the+etiology+of+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied%22%5BJournal%5D)">Aberrant epigenetic patterns in the etiology of gastrointestinal cancers.</a> Journal of applied. 49, 1-10 (2008).</li>
<li>Maekawa, M., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics%3A+relations+to+disease+and+laboratory+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Current+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetics: relations to disease and laboratory findings.</a> Current medicinal chemistry. 14, 2642-2653 (2007).</li>
<li>Vucic, E. A., Brown, C. J., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of cancer progression.</a> Pharmacogenomics. 9, 215-234 (2008).</li>
<li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429, 457-463 (2004).</li>
<li>Jones, P. A., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+role+of+epigenetic+events+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The fundamental role of epigenetic events in cancer.</a> Nat Rev Genet. 3, 415-428 (2002).</li>
<li>Fraga, M. F., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation%3A+a+profile+of+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">DNA methylation: a profile of methods and applications.</a> Biotechniques. 33, 632-649 (2002).</li>
</ol>

Há uma consciência crescente do papel significativo desempenha na doença de metilação do DNA, portanto, o desenvolvimento de ensaios para medir esta modificação estão se tornando cada vez mais importante 3, 12, 13. A técnica MEDIP é um instrumento favorável para triagem, tanto do genoma inteiro-o e locus específico de nível 6, 7. Esta técnica oferece uma visão rápida dos níveis de metilação do DNA usando quantidades limitadas de partida DNA e permite comparações fáceis entre diferentes fontes. Apli...

<table><tbody><tr><td>Sonicador Biorupter</td><td>Ferramenta</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200 TM</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga SafeSeal de 1,7 ml</td><td>Outro</td><td>Sorenson BioScience</td><td>11510</td><td></td></tr><tr><td>Espetrofotômetro ND 3300</td><td>Ferramenta</td><td>NanoDrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Primário: Anti-5&amp;rsquo;-metilcitosina mouse mAb</td><td>Reagente</td><td>Calbiochem</td><td>162 33 D3</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Secundário: Dynabeads M-280 Ovelha anti-mouse IgG</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>112-01D</td><td></td></tr><tr><td>Grade Magnética para Tubos</td><td>Ferramenta</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Ferramenta</td><td>Labnet International</td><td>H5500</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de IP</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM NaPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; pH 7,0, 140 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. Armazenado à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Tampão de Digestão</td><td></td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 8,0, 100 mM EDTA, 0,5% SDS, 50 mM NaCl</td></tr></tbody></table>

imunoprecipitação dna metilado

Methylated DNA Immunoprecipitation

A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, como a metilação é conhecido por ter efeitos significativos sobre a expressão gênica, e está envolvida com desenvolvimento normal, bem como doença<sup&gt; 04/01</sup&gt;. Assim, a capacidade de discriminar entre o DNA metilado e não metilado-DNA é essencial para a geração de perfis de metilação para esses estudos. Metilado DNA imunoprecipitação (MEDIP) é uma técnica eficiente para a extração de DNA metilado partir de uma amostra de interesse<sup&gt; 07/05</sup&gt;. Uma amostra de tão pouco como 200 ng de DNA é suficiente para o anticorpo, ou imunoprecipitação (IP), a reação. DNA é sonicado em fragmentos que variam em tamanho de 300-1000 pb, e está dividido em immunoprecipitated (IP) e de entrada (IN) parcelas. DNA IP é posteriormente calor desnaturado e, em seguida, incubadas com anti-5&#39;mC, permitindo que o anticorpo monoclonal de se ligar DNA metilado. Após isso, esferas magnéticas contendo um anticorpo secundário com afinidade para o anticorpo primário são adicionados e incubados. Estes anticorpos bead-linked ligará o anticorpo monoclonal utilizado na primeira etapa. DNA ligado ao complexo de anticorpos (DNA metilado) é separado do resto do DNA usando um ímã para puxar os complexos de solução. Várias lavagens com tampão IP são, então, realizada para remover o desacoplado, DNA não-metilado. O DNA metilado / anticorpo complexos são então digeridos com proteinase K para digerir os anticorpos, deixando apenas o DNA metilado intacta. O DNA enriquecido é purificado por fenol: clorofórmio extração para remover a matéria de proteínas e, em seguida, precipitado e ressuspenso em água para uso posterior. Técnicas de PCR pode ser usado para validar a eficiência do procedimento MEDIP pela análise dos produtos de amplificação de IP e no DNA das regiões conhecidas por falta e conhecido por conter seqüências metiladas. O DNA purificado metilado pode então ser usada para o locus-específica (PCR) ou genome-wide (microarray e seqüenciamento) Estudos de metilação, e é particularmente útil quando aplicado em conjunto com outras ferramentas de pesquisa, tais como perfil de expressão gênica e hibridização genômica comparativa de matriz ( CGH)<sup&gt; 8</sup&gt;. Uma investigação mais aprofundada para metilação do DNA levará à descoberta de novos alvos epigenéticos, que por sua vez, pode ser útil no desenvolvimento de novas ferramentas de pesquisa terapêutica ou prognóstico para doenças como o câncer que se caracterizam por DNA metilado aberrantemente<sup&gt; 2, 4, 9-11</sup&gt;.

Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).

Imunoprecipitação DNA metilado

A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, visto que se sabe que a metilação exerce efeitos significativos sobre...

Este vídeo demonstra um protocolo para imunoprecipitação de DNA metilado ou meetup. Um método utilizado para isolar especificamente DNA metilado de maneira imparcial. A metilação de DNA em mamíferos é caracterizada pela adição de um grupo metila à posição C5 da citosina.Quando presente em um dinucleotídeo CPG, trata-se de uma marca epigenética reversível que desempenha um papel importante no desenvolvimento normal, bem como em diversos processos de doenças. As funções normais da metilação do DNA incluem a inativação do cromossomo X em fêmeas, o silenciamento de elementos repetitivos, a impressão genômica e a manutenção da estabilidade genômica. A metilação do DNA também demonstrou desempenhar um papel em inúmeras doenças, como câncer, síndrome de Prader-Willi, síndrome de ICF (imunodeficiência, instabilidade centromérica e anomalias faciais) e síndrome de Rett.Em cânceres, por exemplo, a hipermetilação anormal e os promotores podem resultar no silenciamento de genes vitais supressores de tumor. Enquanto a hipometilação inadequada resulta em instabilidade cromossômica e ativação de oncogenes, a reunião é realizada primeiramente pela sonicação do DNA em fragmentos com tamanhos varian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Este vídeo descreve a técnica de dot-blot para determinar o nível de metilação do DNA em condrócitos humanos in vitro por meio do blotting de amostras de DNA em uma membrana de náilon e a visualização subsequente usando anticorpos monoclonais. Isso ajuda a determinar o fenótipo dos condrócitos em vários estágios da cultura.

Dot Blot de 5-metilcitosina para determinar a extensão da metilação do DNA

O sequenciamento de bissulfito de representação reduzida aprimorada é um método para a preparação de bibliotecas de sequenciamento para análise de metilação de DNA com base na digestão de enzimas de restrição combinada com conversão de bissulfito de citosina. Este protocolo requer 50 ng de material de partida e produz dados de resolução de pares de bases em regiões genômicas ricas em GC.

Aprimorada Redução Representação Bisulfite Sequencing para a Avaliação de metilação de DNA na resolução de pares de bases

A metilação do DNA é capaz de manter níveis estáveis de expressão gênica, além de permitir mudanças dinâmicas na expressão gênica em resposta a uma variedade de estímulos. Detalhamos técnicas que permitem o estudo de alterações específicas de genes na metilação do DNA e o efeito dessas mudanças na expressão gênica.

Correlacionando DNA Alterações metilação específico do gene com expressão e transcrição Atividade de astrocítica<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Aqui apresentamos um protocolo para investigar a metilação do DNA do genoma ampla em grande escala estudos de triagem de pacientes clínicos utilizando o Metil-Binding tecnologia de sequenciamento de DNA Captura (MBDCap-seq ou MBD-seq) eo gasoduto análise bioinformática subsequentes.

Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

Este trabalho descreve um protocolo optimizado de sequenciação de domínio de ligação de metil-CpG (MBD) e uma tubagem computacional para identificar regiões ricas em CpG diferencialmente metiladas em pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL).

Análise abrangente de metilação de DNA usando um método baseado em captação de domínio de ligação de metil-CpG em pacientes com leucemia linfocítica crônica

Este trabalho descreve um protocolo para a imunoprecipitação de cromatina (ChIP) usando uma linha de células T de mouse maduras. Este protocolo é adequado para investigar a distribuição de marcas de histonas específicas em locais promotores específicos ou em todo o genoma.

Imunoprecipitação de cromatina (ChIP) em linhas de células T de mouse

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta poderosa para a compreensão dos mecanismos moleculares da regulação genética. No entanto, o método envolve dificuldades na obtenção de fragmentação cromatina reprodutível por cisalhamento mecânico. Aqui, nós fornecemos um protocolo melhorado para um ensaio da microplaqueta usando a digestão enzimática.

Ensaio de imunoprecipitação cromatina utilizando nucleases Microcócicas em células de mamíferos

O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis

Aprenda a técnica de imunoprecipitação de DNA metilado (MeDIP) para isolar fragmentos de DNA metilado de forma não enviesada. Este método é essencial para estudos de epigenética e investigação de mecanismos de doenças como o câncer.

Imunoprecipitação DNA metilado

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