Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

O meu nome é Maria e estou a trabalhar na Y Healthcare na NOS, na Suécia. As proteínas da superfície celular estão frequentemente envolvidas na comunicação entre as células e seu ambiente e, portanto, são de interesse particular na pesquisa, com o objetivo de obter mais informações sobre doenças, bem como outras variações biológicas induzidas por mudanças no ambiente celular. Neste vídeo, vou mostrar um protocolo simples de marcação da superfície celular de esquiva lateral e você poderá enriquecer visualmente essas proteínas pouco abundantes sem aprimoramento físico e estudar as diferenças dessas proteínas da superfície celular com a tecnologia.

Se você achar essa tecnologia interessante, poderá encontrar mais informações no manual 2D. Além disso, temos uma nota de aplicação sobre este tópico específico que você pode baixar do trabalho No protocolo de rotulagem da superfície celular visto na parte superior, você rotula as células enquanto elas ainda estão intactas. Durante o processo de rotulagem, o corante só terá acesso às proteínas da superfície celular.

Após a etapa de rotulagem, as células são analisadas para verificar a marcação específica da superfície celular. A amostra do rótulo foi fracionada em proteínas de membrana e citosólicas. Uma amostra não fracionada foi preparada em paralelo.

Para comparação, esta análise de fracionamento não é necessária, mas foi feita aqui apenas para mostrar que o protocolo de superfície celular é específico para dicas profissionais de superfície celular. Também realizamos o protocolo padrão de rotulagem ETH sem dieta, visto abaixo das células são mentiras antes da rotulagem e, dessa forma, todas as proteínas celulares são acessíveis para rotulagem. Após a etapa de rotulagem, as amostras são submetidas à eletroforese 2D.

As células aderentes são destacadas usando um procedimento não enzimático para evitar a digestão das proteínas da superfície celular visadas. Neste protocolo, usamos o policial de borracha, mas o uso de meios de dissociação de três células enzimáticas também é uma contagem de opções e dividimos as suspensões celulares em quas de cinco a 10 milhões de células por tubo. As células são então peletizadas e lavadas em H-P-S-S-P-H 7.4 para remover vestígios de cultura celular.

A contaminação do meio por proteínas séricas e componentes fluorescentes pode interferir na marcação e detecção. As células que crescem em suspensão são diretamente peletizadas e lavadas antes da etapa de rotulagem após a lavagem. A paleta de células é ressuspensa em tampão de rotulagem gelado de 200 microlitros contendo HPSS pH 8,5 e uma uria molar.

Para condições ideais de marcação de proteínas de superfície celular, sempre verifique o pH. Antes da rotulagem, usamos 600 molde pic para 10 milhões de células CHO. A proporção ideal de olho lateral para número de células varia de acordo com o tipo de célula.

Uma vez que não sabemos as concentrações exatas de proteínas na superfície celular. Como determinar as condições ideais para a marcação lateral de proteínas é descrito no manual de princípios e métodos de eletroforese 2D. As células são incubadas com o piso D do olho lateral, dados mínimos por 20 minutos no gelo no escuro.

Após a reação de rotulagem, o corante não reativo é extinto pela adição de 20 microlitros de lisina 10 milimolar. As células do rótulo agora são lavadas duas vezes em tampão HPSS pH 7,4 frio para remover o excesso de olho lateral. Portanto, não haverá corante livre para marcação intracelular indesejada ou proteínas na próxima etapa, que é a lise celular.

As proteínas na superfície celular agora estão marcadas e as células são lavadas e prontas para serem cortadas. O pellet da etapa de lavagem perdida é ressuspenso em tampão de lise a frio de 150 microlitros contendo sete uria molar, dois thi uria molar, 4% chaps 30 árvores milimolares acetato de magnésio cinco milimolares pH 8,5 e deixado no gelo por pelo menos uma hora com tributação ocasional de vórtice. As amostras agora estão prontas para a separação 2D.

O primeiro passo para a eletrólise é preparar as tiras IPD para reidratação. Prepare a solução de reidratação distrital adicionando tampão IPG correspondente ao intervalo de pH das tiras usadas e adicione a solução na lente da bandeja de reidratação. Remova a película protetora da tira IPG e coloque as tiras cuidadosamente com um gel seco voltado para baixo na bandeja de reidratação que contém a solução de reidratação.

Feche a tampa da caixa IPG e reidrate as tiras durante a noite. Na primeira dimensão, foco isoelétrico, as proteínas são separadas de acordo com seu pi. Isso é feito usando o IPG quatro três.

As tiras reidratadas são colocadas no coletor e o eletrodo é montado na parte superior. 50 microgramas de cada amostra foram aplicados usando tampas de aplicação de amostra. Aplicamos diretamente amostras não fracionadas sem fracionamento prévio ou fracionamos as amostras em frações de membrana e citosólicas antes de serem aplicadas.

O chumbo é fechado para proteger as amostras fluorescentes da luz. O instrumento foi programado de acordo com a recomendação e executado durante a noite. Géis grandes de 12% lamby foram custados usando gel adulto 12.

A solução de deslocamento de coster foi adicionada para evitar géis de acry polimerizados nas tubulações. Os géis foram polimerizados durante a noite em temperatura ambiente antes do uso. Após a focalização isoelétrica, as tiras são removidas e equilibradas em SDS contendo tampão em duas etapas usando DTT para reduzir as ligações de dissulfeto de resíduos de cisteína seguidas de alquilação com sua acetamida para evitar modificação por acrilamida.

As tiras IPG são mergulhadas em tampão de corrida e cuidadosamente colocadas em cima dos dois grandes géis de escavação. Evite prender o ar entre as tiras e o gel selado adicionando solução 2% agro derretida com bromo anol blue por cima. Os géis agora estão prontos para a separação de página SDS de segunda dimensão na página SDS de segunda dimensão.

As proteínas serão separadas de acordo com o peso molecular e isso é realizado com o sistema tonal seis. Encha a câmara de eletroforese com tampão de corrida anódico, insira os géis e encha o compartimento superior com o programa de tampão de corrida catódico. A fonte de alimentação de acordo com as recomendações e executar a segunda dimensão protegida da luz por aproximadamente quatro a cinco horas ou até que a frente do corante atinja o fundo do gel.

Após a eletroforese de segunda dimensão, os de gel são colocados usando as pinças no gerador de imagens fluorescente do tufão. Dois géis e três canais podem ser escaneados simultaneamente. O resultado desses dois DL mostra alta resolução de proteínas de membrana na amostra, mesmo que existam algumas restrições conhecidas para proteínas hidrofóbicas a serem detectadas em A dois DL. Os resultados mostram muitos novos pontos de rótulo de superfície celular mostrados aqui em vermelho que não são detectados usando o protocolo de marcação padrão mostrado aqui em verde.

Esses resultados mostram que o protocolo de marcação da superfície celular é altamente específico para a marcação de proteínas da superfície celular. Como as proteínas da superfície celular são marcadas exclusivamente, elas são mais facilmente visualizadas e a atenuação por proteínas citosólicas abundantes é evitada. A imagem fluorescente de géis com fração de membrana não fracionada ou fração citosólica é mostrada na parte superior.

Abaixo está uma imagem da mesma mancha de gel com prata. Os resultados não mostram marcação fluorescente de proteínas citosólicas, mas a coloração de prata mostra que existem proteínas nos géis. Os resultados também mostram padrões semelhantes de mapas de pontos de frações não fracionadas e de membrana, demonstrando que não há necessidade de fracionamento antes da eletroforese 2D, o que torna este protocolo simples e conveniente.

O SI dois, o SI três e o SCI cinco apresentam padrões de marcação semelhantes e são todos compatíveis com o protocolo de superfície das células. Um experimento de dieta foi realizado usando todos os três lados do olho DI floor minimal dy para estudar a expressão diferencial de proteínas da superfície celular em células CHO da fome sérica por diferentes períodos de tempo. CY, duas amostras de superfície celular de todas as amostras do experimento foram agrupadas e usadas como padrão interno.

As mudanças diferenciais de várias proteínas da superfície celular podem ser acompanhadas durante o período de fome. Mais de 18 novas proteínas de membrana foram detectadas usando o protocolo de superfície celular que não foram detectadas com o protocolo padrão para encontrar a identidade das proteínas no gel preparativo. Foi necessário aumentar com a amostra da superfície celular para facilitar a correspondência com os pontos no conjunto de dados analíticos.

Aí resulta. Os resultados mostram uma alta resolução de um grande número de proteínas da superfície celular. Este protocolo é muito específico para proteínas de superfície celular e nenhuma marcação de proteínas intracelulares foi observada.

Com esse método, você pode detectar mais proteína da superfície celular em comparação com um protocolo padrão e, como já viu, é um protocolo muito simples de executar. Você simplesmente rotula suas proteínas da superfície celular enquanto elas ainda estão intactas e as executa diretamente na eletroforese 2D sem fracionamento da membrana. Portanto, este é um protocolo muito bom para estudar proteínas de superfície celular e as diferenças daquelas com a tecnologia D.