Name: Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprenda a rotular proteínas de superfície celular usando CyDye DIGE Fluor Minimal sem fracionamento. Este método permite detectar proteínas de baixa abundância e estudar diferenças na expressão com eletroforese bidimensional.

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Agradecemos a Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer e Sigurd Krieger no Instituto de Patologia Clínica, Universidade de Viena, na Áustria, por sua colaboração.

Cultura de células <ol><li> Cultivar células de ovário de hamster chinês (CHO-K1), utilizando os procedimentos padrão de cultura de células em F-12 com meio Ham Glutamax I contendo 10% de soro fetal bovino, 50 U / ml de penicilina, e 50 mcg / ml de sulfato de estreptomicina (Invitrogen). </li><li> Trocar o meio de cultura sem soro para meios de comunicação. Proteínas rótulo superfície da célula foram em momentos diferentes com CyDye DIGE Fluor Cy3 ou Cy5 corantes mínimo (ver secção Labeling superfície celular, abaixo). </li><li> Piscina números iguais de células de cada momento e etiqueta com CyDye DIGE Fluor Cy2. Usá-los como um padrão interno para cada gel 2-D. </li><li> A maioria dos experimentos podem ser realizados com células CHO-K1, mas fibroblastos de rato embrião (L1 3T3) e linfoblastos rato ascite linfoma (EL4) também pode ser usada (dados não mostrados). </li><li> Crescer os dois últimos tipos de células em DMEM com Glutamax II, mas, caso contrário, use condições idênticas usada para as células CHO-K1. </li></ol> Rotulagem superfície celular <ol><li> Cuidadosamente separar células aderentes não enzimaticamente, contando e dividindo-se alíquotas de 5-10 células x106. Para células cultivadas em suspensão, omita o passo destacando. </li><li> Centrifugar a suspensões de células em cerca de 800 xg por 5 minutos. Remover o sobrenadante contendo o meio. </li><li> Lavar as pelotas por resuspendion em solução 1 ml de gelo frio Hank salina balanceada (HBSS) pH 8.5. Centrifugado a 800 xg, a 4 ° C por 2 minutos. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 200 mL de buffer rotulagem gelada (HBSS pH 8.5, 1 M uréia). </li><li> Rótulo as células intactas com 600 pmol CyDye corantes DIGE Fluor mínimo por 20 minutos no gelo no escuro. </li><li> Saciar a reação pela adição de 20 l 10 mM de lisina. Incubar por 10 minutos. </li><li> Lavar a superfície marcada com células duas vezes por ressuspensão em 500 mL pH HBSS 7,4, seguido por centrifugação a 800 xg, a 4 ° C por 2 minutos. </li></ol> Lise celular e fracionamento <ol><li> Lisar a superfície marcada com células em 150 mL tampão de lise fria (7 uréia M, 2 M tiouréia, 4% CHAPS, 30 mM Tris, pH 5 mM de acetato de magnésio 8,5). Deixe na geladeira por pelo menos 1 h com vórtex ocasionais. </li><li> Centrifugar a lisados ​​em 10 000 xg, a 4 ° C por 5 minutos. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Esta amostra é a amostra não fracionada contendo todas as proteínas celulares. </li><li> Em paralelo, lave pellets de células, como acima, então fracionar (usando um kit de fracionamento de membrana, Pierce) em membrana e frações citosólica antes de 2-D eletroforese em gel. A fração de membrana contém proteínas da membrana interna e da superfície celular. </li><li> Para efeito de comparação, seguem o padrão Ettan procedimento DIGE 3, e lise, rótulo, e, finalmente, fracionar as células. Determinar a concentração de proteína nas amostras utilizando a 2 - D Quant Kit (GE Healthcare). </li></ol> 2-D electrophoresis <ol><li> Reidratar géis DryStrip Immobiline, pH 3-11NL (24 cm) usando bandeja DryStrip Immobiline Reswelling, 24 cm em 450 mL de solução DeStreak Reidratação (0,5% IPG Buffer) durante a noite. </li><li> Aplicar o CyDye marcado amostras (correspondente a 50 mg de proteína total) para Immobiline DryStrip carregando géis copo anódica no coletor e realizar focalização isoelétrica (IEF), utilizando Ettan IPGphor II Sistema IEF acordo com as instruções. </li><li> Depois IEF, equilibrar as tiras em duas etapas e coloque em cima de grandes dimensões (26 x 20 cm) géis de poliacrilamida 12,5% (SDS-PAGE). Sobreposição com agarose 0,5% (em tampão de corrida contendo azul de bromofenol). Executar 2-D electrophoresis usando Ettan DALTtwelve Sistema Vertical Grande a 5 W / gel por 30 min, e depois de 15 W / gel até que a frente de corante atinge o fundo do gel. </li></ol> De imagem e análise de dados <ol><li> Depois de completar 2-D electrophoresis, digitalizar os géis para Cy2, Cy3 ou Cy5 usando um Typhoon 9410 Imager modo variável. </li><li> Compare os mapas no local a partir de frações de membrana, frações citosólica e não-fracionada amostras usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial 4. </li></ol> Pós-coloração <ol><li> Depois de imagem, prata manchar o gel de acordo com procedimento padrão 5. </li></ol> Identificação de proteínas <ol><li> Crescer, colheita, lavagem e lisar quantidades preparativa (aproximadamente 1 mg de proteína total de 10 x106 células CHO) de células, como descrito acima para uma amostra não-fracionada. Use uma amostra Cy5 superfície da célula marcada (veja acima) como um pico, e aplicado em conjunto com os montantes unlabelled preparativa de proteínas. </li><li> Realização de eletroforese 2-D, como descrito acima, mas desta vez, aplly 600 mg de células unlabeled lisado em conjunto com 50 mg de superfície celular rotulados pico anódica por aplicação copo. Use os marcadores de referência para permitir escolher ponto correto, e coloque aentre as placas de vidro antes de lançar gel acordo com as recomendações 3. </li><li> Digitalizar o gel em Cy5 canal para obter as células Cy5 mapa de locais de superfície, seguido por coloração de proteínas totais utilizando proteína total Deep Purple mancha 3. </li><li> Partida em conjunto os dois mapas no local usando o DeCyder 2-D de software e criar uma lista de seleção para todos os pontos correspondentes às cinco Cy proteínas de superfície celular rotulados. Escolha proteínas da superfície celular usando a estação de tratamento de Ettan spot, extrair as fichas gel, e usando o digestor trypsinate Ettan. Identificar utilizando MALDI-TOF espectrometria de massa. </li></ol> Tabela 1. Ettan Um experimento DIGE foi realizada utilizando amostras de soro de células esgotados rotuladas de acordo com o protocolo de rotulagem da superfície celular da proteína na figura 1. <table style="width: 517px; height: 139px;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Amostra </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Tempo de esgotamento do soro </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Rotulados com CyDye </td><td style="text-align:center; font-weight:bold"> Número de gel </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 1 </td><td style="text-align:center;"> - </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, 2 Cy </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 2 </td><td style="text-align:center;"> 30 minutos </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, 2 Cy </td><td style="text-align:center;"> 1 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 3 </td><td style="text-align:center;"> 2 horas </td><td style="text-align:center;"> Cy 3, 2 Cy </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 4 </td><td style="text-align:center;"> 4 horas </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, 2 Cy </td><td style="text-align:center;"> 2 </td></tr><tr><td style="text-align:center;"> 5 </td><td style="text-align:center;"> 16 horas </td><td style="text-align:center;"> Cy 5, 2 Cy </td><td style="text-align:center;"> 3 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+the+cell+surface+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Profiling of the cell surface proteome.</a> Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).</li>
<li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ettan+DIGE+System+User+Manual%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+user+manual+18-1164-40%22%5BJournal%5D)">Ettan DIGE System User Manual.</a> GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients%2C+principles+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+handbook+80-6429-60+Edition+AB%22%5BJournal%5D)">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li>
<li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> Proteomics. 2, 579-5785 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li>
</ol>

Concentração de proteína Uma visão geral dos dois fluxos de trabalho rotulagem é mostrado na Figura 1. Uma vez que as células ainda estão intactas quando rotuladas de acordo com o protocolo de rotulagem de proteína da superfície celular, apenas as proteínas de superfície das células são expostas ao corante. No padrão Ettan DIGE protocolo, as células são lisadas antes de rotulagem e proteínas tanto dentro como fora da célula são rotulados (Fig. 1). A quantidade relativa de corante à proteína no...

<table><tbody><tr><td>Kit CyDye DIGE, 2 nmol</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9345-30</td><td></td></tr><tr><td>Kit 2-D Quant</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>Tampão IPG pH 3-11NL</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6004-40</td><td></td></tr><tr><td>Fita Seca Immobiline pH 3-11NL, 24 cm</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-77</td><td></td></tr><tr><td>IPGbox</td><td>Ferramenta</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-65</td><td></td></tr><tr><td>Kit IPGbox</td><td>Ferramenta</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9334-92</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Reidratação DeStreak</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6003-19</td><td></td></tr><tr><td>Fluido de Cobertura para Fita Seca Immobiline</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>Unidade Ettan IPGphor 3 IEF</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Manifold Ettan IPGphor</td><td>Componente de instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6498-38</td><td></td></tr><tr><td>Formador de Gel Ettan DALTtwelve</td><td>Ferramenta</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6467-22</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Separação Ettan DALTtwelve e Fonte de Alimentação/Unidade de Controle</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6466-46</td><td>Unidade 230 V: 80-6466-27</td></tr><tr><td>Imager de Modo Variável Typhoon 9410</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-81</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de Manchas Ettan</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1145-28</td><td></td></tr><tr><td>Digestor Ettan</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-68</td><td></td></tr><tr><td>Dispensador Ettan</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-67</td><td></td></tr><tr><td>Ettan MALDI-TOF</td><td>Instrumento</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-33</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise Diferencial Bidimensional DeCyder</td><td>Outro</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4012-01</td><td></td></tr><tr><td>Software de Análise ImageQuant</td><td>Outro</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9236-62</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1319-01</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1314-01</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT) PlusOne</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1318-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol Azul</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1329-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1321-01</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de Sódio (SDS)</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1313-01</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 87% PlusOne</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1325-01</td><td></td></tr><tr><td>ReadySol IEF 40% T, 3% C PlusOne</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1310-01</td><td></td></tr><tr><td>TEMED PlusOne</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de Amônio PlusOne</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1311-01</td><td></td></tr><tr><td>Glicina PlusOne</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Preparação de Amostra 2-D para proteínas de membrana</td><td>Reagente</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89864</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando dyes cydye dige fluor minimal

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

Proteínas de superfície são fundamentais para a capacidade da célula para reagir ao seu ambiente e interagir com as células vizinhas. Eles são conhecidos por serem indutores de quase todos os de sinalização intracelular. Além disso, eles desempenham um papel importante na adaptação ambiental e tratamento de drogas, e muitas vezes são envolvidos na patogênese da doença e patologia (1). Interações proteína-proteína são intrínsecos a vias de sinalização, e para ter mais conhecimento nesses processos biológicos complexos, métodos sensíveis e confiáveis ​​são necessárias para estudar as proteínas de superfície celular. Eletroforese bidimensional (2-D) é amplamente utilizado para detecção de biomarcadores e outros alvos em amostras de proteínas complexas para estudar mudanças diferencial. Proteínas da superfície celular, em parte devido à sua baixa abundância (1 2% de proteínas celulares), são difíceis de detectar, em um gel 2-D sem fracionamento ou algum outro tipo de enriquecimento. Eles também são muitas vezes mal representado em 2-D gels devido à sua natureza hidrofóbica e alto peso molecular (2). Neste estudo, apresentamos um novo protocolo para células intactas usando corantes CyDye DIGE Fluor mínima para a rotulagem específica e detecção deste importante grupo de proteínas. Os resultados mostraram rotulagem específica de um grande número de proteínas de superfície celular com rotulagem mínima de proteínas intracelulares. Este protocolo é rápido, simples de usar, e os três corantes CyDye DIGE Fluor mínima (Cy 2, 3 e Cy Cy 5) pode ser usado para rotular as proteínas da superfície celular. Esses recursos permitem a multiplexação usando o 2-D Eletroforese Gel Fluorescence Difference (2-D DIGE) com tecnologia Ettan DIGE e análise das mudanças da proteína expressão usando DeCyder 2-D Software Análise Diferencial. O nível de proteínas da superfície celular foi seguido durante a inanição de soro de células CHO para vários comprimentos de tempo (ver Tabela 1). Pequenas mudanças em abundância foram detectados com alta precisão, e os resultados são apoiados por métodos estatísticos definidos.

Um método simples e específica foi demonstrada para marcação fluorescente e detecção aprimorada de proteínas de superfície das células sem uma etapa de fracionamento. Abundância diferencial de proteínas de superfície celular foi analisada através de eletroforese bidimensional (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

As proteínas de superfície são fundamentais para a capacidade da célula de reagir ao seu ambiente e de interagir com células vizinhas. Sabe-se que elas são indutoras de...

Meu nome é Maria e eu trabalho na Y Healthcare em NOS, na Suécia. As proteínas da superfície celular estão frequentemente envolvidas na comunicação entre células e seu ambiente, sendo, portanto, de particular interesse na pesquisa, com o objetivo de obter maior compreensão sobre doenças, bem como outras variações biológicas induzidas por alterações no ambiente celular. Neste vídeo, vou mostrar a vocês um protocolo simples de marcação da superfície celular por método de desvio lateral, permitindo enriquecer visualmente essas proteínas de baixa abundância sem reforço físico e estudar as diferenças dessas proteínas de superfície celular com a tecnologia.Se você achar essa tecnologia interessante, pode encontrar mais informações no manual 2D. Além disso, temos uma nota de aplicação sobre este tópico específico, que você pode baixar do job. No protocolo de marcação da superfície celular mostrado acima, você marca as células enquanto elas ainda estão intactas. Durante o processo de marcação, o corante terá acesso apenas às proteínas da superfície celular.Após a etapa de marcação, as células são analisadas para verificar a marcação específica na superfície celular. A amostra marcada foi fracionada em proteínas de membrana e citosólicas. Uma amostra não fracionada foi preparada em paralelo.Para comparação, esta análise de fracionamento não é necessária, mas foi realizada aqui apenas para demonstrar que o protocolo de superfície celular é específico para as pontas protéicas da superfície celular. Também realizamos o protocolo padrão de marcação sem dieta ETH, conforme mostrado abaixo: as células são lisadas antes da marcação, e dessa forma todas as proteínas celulares ficam acessíveis para marcação. Após a etapa de marcação, as amostras são submetidas à eletroforese bidimensional.Células aderentes são destacadas utilizando um procedimento não enzimático para evitar a digestão das proteínas de superfície celular alvo. Neste protocolo, utilizamos o raspador de borracha, mas o uso de meio de dissociação celular enzimático também é uma opção. Contamos e dividimos as suspensões celulares em alíquotas de cinco a dez milhões de células por tubo. As células são então centrifugadas e lavadas em H-P-S-S-P-H 7,4 para remover traços de cultura celular.A contaminação do meio por proteínas séricas e componentes fluorescentes pode interferir na marcação e detecção. Células em crescimento em suspensão são diretamente centrifugadas e lavadas antes da etapa de marcação, após a lavagem. A suspensão celular é ressuspendida em 200 microlitros de tampão de marcação gelado contendo HPSS pH 8,5 e uma molar uréia.Para condições ideais de marcação de proteínas de superfície celular, verifique sempre o pH. Antes da marcação, utilizamos 600 picomols de side-eye para 10 milhões de células CHO. A proporção ideal de side-eye em relação ao número de células variará conforme o tipo celular.Como não conhecemos as concentrações exatas das proteínas na superfície celular, como determinar as condições ideais para a marcação lateral de proteínas é descrito no manual de princípios e métodos de eletroforese 2D. As células são incubadas com side eye D floor, dado mínimo, por 20 minutos no gelo e no escuro.Após a reação de marcação, o corante não reativo é inativado pela adição de 20 microlitros de lisina 10 milimolar. As células marcadas são agora lavadas duas vezes em tampão HPSS pH 7,4 frio para remover o excesso de corante. Assim, não haverá corante livre restante para marcação intracelular indesejada ou proteínas na próxima etapa, que é a lise celular.As proteínas na superfície celular estão agora marcadas e as células são lavadas e preparadas para serem lisadas. O pellet da última etapa de lavagem é ressuspenso em 150 microlitros de tampão de lise frio contendo sete molar ureia, dois molar tioureia, 4% CHAPS, trinta milimolar Tris, cinco milimolar acetato de magnésio, pH 8,5, e mantido no gelo por pelo menos uma hora com vortexação ocasional. As amostras estão agora prontas para a separação em 2D.O primeiro passo para a eletroforese é preparar as tiras IPD para a reidratação. Prepare a solução de reidratação específica adicionando o tampão IPG correspondente ao intervalo de pH das tiras utilizadas e adicione a solução na lente da bandeja de reidratação. Remova a película protetora da tira IPG e posicione cuidadosamente as tiras com o gel seco voltado para baixo na bandeja de reidratação contendo a solução de reidratação.Feche a tampa da caixa IPG e reidrate as tiras durante a noite. Na primeira dimensão, a focalização isoelétrica, as proteínas são separadas de acordo com seu pi. Isso é realizado usando o IPG four three.As tiras reidratadas são colocadas na placa de aplicação e o eletrodo é montado na parte superior. Foram aplicados 50 microgramas de cada amostra utilizando tampas de aplicação de amostra. Aplicamos diretamente amostras não fracionadas, sem fracionamento prévio, ou fracionamos as amostras em frações membranar e citosólica antes de sua aplicação.A tampa é fechada para proteger as amostras fluorescentes da luz. O instrumento foi programado de acordo com a recomendação e executado durante a noite. Grandes géis de 12% lamby foram preparados usando o sistema adulto 12 gel.Adicionou-se solução deslocadora Coster para evitar géis de acrilamida polimerizados nas tubulações. Os géis foram deixados para polimerizar durante a noite à temperatura ambiente antes do uso. Após a focalização isoelétrica, as tiras são removidas e equilibradas em tampão contendo SDS em dois passos, utilizando DTT para reduzir as ligações dissulfeto dos resíduos de cisteína, seguido de alquilação com acetamida para evitar modificações pela acrilamida.As tiras IPG são mergulhadas no tampão de corrida e cuidadosamente colocadas sobre os grandes géis bidimensionais. Evite aprisionar ar entre as tiras e o gel selando com uma solução fundida de agarose a 2% contendo azul de bromofenol por cima. Os géis estão agora prontos para a separação em segunda dimensão por SDS-PAGE. Na segunda dimensão SDS-PAGE.As proteínas serão separadas de acordo com o peso molecular e isso é realizado com o sistema tonal six. Preencha a câmara de eletroforese com tampão de corrida anódico, insira os géis e preencha o compartimento superior com tampão de corrida catódico. Conecte a fonte de alimentação conforme as recomendações e realize a segunda dimensão protegida da luz por aproximadamente quatro a cinco horas ou até que a frente do corante alcance a base do gel.Após a eletroforese em segunda dimensão, as cassetes de gel são posicionadas com o auxílio de pinças no imageador fluorescente Typhoon. Dois géis e três canais podem ser escaneados simultaneamente. O resultado dessa 2DE mostra alta resolução de proteínas de membrana na amostra, mesmo que existam algumas limitações conhecidas para a detecção de proteínas hidrofóbicas em uma 2DE. Os resultados mostram vários novos pontos de marcação na superfície celular, exibidos aqui em vermelho, que não são detectados utilizando o protocolo de marcação padrão mostrado aqui em verde.Esses resultados mostram que o protocolo de marcação da superfície celular é altamente específico para marcar proteínas de superfície celular. Como as proteínas de superfície celular são marcadas exclusivamente, elas são mais facilmente visualizadas e evita-se a atenuação causada por proteínas citosólicas abundantes. A imagem fluorescente de géis com fração de membrana não fracionada ou fração citosólica é mostrada na parte superior.Abaixo está uma imagem do mesmo gel após coloração com prata. Os resultados mostram ausência de marcação fluorescente de proteínas citosólicas, mas a coloração com prata demonstra que há proteínas nos géis. Os resultados também mostram padrões semelhantes de mapas de spots nas frações não fracionadas e nas frações de membrana, demonstrando que não há necessidade de fracionamento prévio à eletroforese bidimensional, o que torna este protocolo simples e conveniente.SI dois, SI três e SCI cinco mostram padrões de marcação semelhantes e são todos compatíveis com o protocolo de superfície celular. Um experimento com dieta foi realizado utilizando os três tipos de meio mínimo side eye DI para estudar a expressão diferencial de proteínas de superfície celular em células CHO submetidas à privação de soro por diferentes períodos de tempo. As amostras de superfície celular CY dois de todas as amostras do experimento foram agrupadas e utilizadas como padrão interno.As alterações diferenciais de várias proteínas da superfície celular puderam ser acompanhadas durante o período de privação de nutrientes. Mais de 18 proteínas de membrana novas foram detectadas utilizando o protocolo de superfície celular, as quais não foram detectadas com o protocolo padrão para determinar a identidade das proteínas no gel preparativo. Foi necessário adicionar uma alíquota da amostra de superfície celular para facilitar a correspondência com os pontos no conjunto de dados analíticos.Há resultados. Os resultados mostram uma alta resolução de um grande número de proteínas de superfície celular. Este protocolo é muito específico para proteínas de superfície celular e nenhuma marcação de proteínas intracelulares foi observada.Com este método, é possível detectar mais proteínas de superfície celular em comparação com um protocolo padrão, e como você já viu, é um protocolo muito simples de executar. Basta marcar suas proteínas de superfície celular enquanto ainda estão intactas e submetê-las diretamente à eletroforese bidimensional, sem fracionamento da membrana. Assim, este é um excelente protocolo para estudar proteínas de superfície celular e as diferenças entre elas com a tecnologia D.

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Biology

Biologia

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Rotulagem células-tronco com corantes fluorescentes para detecção não invasiva com imagens ópticas

CFSE covalentemente rótulos de longa duração de moléculas intracelulares com o corante fluorescente, carboxifluoresceína. Como tal, quando uma célula se divide CFSE marcado, a sua progenitura têm metade da quantidade de fluorescência, que pode assim ser utilizada para avaliar a divisão celular. Este artigo descreve os procedimentos normalmente utilizados para a rotulagem linfócitos mouse com CFSE.

O Uso de diacetato carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos

O sucesso no uso de corantes de rastreamento celulares para monitorar a função de células imunes e proliferação envolve várias etapas críticas. Descrevemos métodos para: 1) a obtenção de brilhante, uniforme, reprodutível etiqueta ing com corantes de membrana, 2) selecção de fluorocromos e condições de aquisição de dados, e 3) a escolha de um modelo para quantificar a proliferação de células com base na diluição de corante.

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Descreve-se um método para marcar a proteína na superfície de neurónios vivos utilizando um anticorpo policlonal específico para epitopos extracelulares. A proteína ligada pelo anticorpo na superfície da célula e subsequentemente internalizados através de endocitose podem ser distinguidas a partir de proteína restante na, ou vendidas para, a superfície durante a incubação.

Rotulagem diferencial de superfície celular e internalizado Proteínas após Anticorpo Alimentação da Vivo Cultivadas neurônios

Descrevemos aqui um método para identificação de proteínas de ligação a pequenas moléculas usando marcação de fotoafinidade. A vantagem dessa técnica é que a ligação e a marcação covalente das proteínas-alvo ocorrem dentro do ambiente celular vivo, removendo o risco de interromper a estrutura da proteína nativa e as condições de ligação na lise celular.

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.

Isolamento e Activação de Linfócitos murinos

Aqui, apresentamos um protocolo para multi cor localização das proteínas de membrana única em organelas de células vivas. Para anexar fluorophores, auto rotulação de proteínas são utilizadas. Proteínas, localizadas em compartimentos diferentes membranas da organela a mesma, podem ser localizadas com precisão de ~ 18 nm.

Localização de cor multi microscopia de proteínas de membrana única em organelas de células de mamíferos vivas

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a homogeneidade de rotulagem para cada espécie de proteína em uma amostra de proteína complexa a nível da molécula.

Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

O protocolo descreve rotulagem específica de nucleóides mitocondriais com uma mancha de gel de DNA comercialmente disponível, aquisição de série de lapso de tempo de células rotuladas ao vivo por microscopia de iluminação estruturada de super resolução (SR-SIM) e rastreamento automático do movimento nucleóide.

Rotulagem específica de nucleóides mitocondriais para microscopia estruturada de iluminação com lapso de tempo

Corantes fluorescentes vitais são ferramentas essenciais para análises de imagens de células vivas na biologia moderna das células fúngicas. Este artigo detalha a aplicação de corantes fluorescentes estabelecidos e menos conhecidos para rastrear a dinâmica da membrana plasmática, endo-/exocitose e mordogênese da parede celular em fungos filamentous.

Aplicação de corantes fluorescentes seletivos da membrana e da parede de pilha para a imagem latente da Viver-pilha de fungos de Filamentous

Apresentamos um protocolo experimental e um fluxo de trabalho de análise de dados para realizar espectroscopia de correlação transversal de fluorescência de células vivas (FCCS) combinada com a transferência de energia de ressonância förster (FRET) para estudar a dinâmica do receptor de membrana em células vivas usando técnicas modernas de rotulagem de fluorescência.

Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

Aprenda a rotular proteínas de superfície celular usando CyDye DIGE Fluor Minimal sem fracionamento. Este método permite detectar proteínas de baixa abundância e estudar diferenças na expressão com eletroforese bidimensional.

Rotulagem seletiva de proteínas de superfície celular usando Dyes CyDye DIGE Fluor Minimal

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