15.6:

15.6: ДНК-микрочипы

JoVE Core
Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Core Molecular Biology

DNA Microarrays

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Previous Video

15.5: Southern Blot

Next Video

15.7: Complementary DNA

17,263 Views

•

02:34 min

•

April 07, 2021

Overview

Микрочипы — это высокопроизводительные и относительно недорогие анализы, которые могут быть автоматизированы для одновременного анализа больших объемов данных. Они используются в полногеномных исследованиях для сравнения экспрессии генов или белков в двух различных условиях, таких как здоровое и больное состояние. Микрочипы состоят из стеклянных или кремнеземных стекол, к которым молекулы зонда ковалентно прикрепляются посредством функционализации поверхности. Чаще всего предметные стекла получают путем хемосорбции силанов на поверхности кремнезема.

В то время как ДНК-микрочипы используются для мониторинга экспрессии генов, белковые микрочипы обнаруживают биологически значимые взаимодействия флуоресцентно меченного белка с другими белками, ДНК или малыми молекулами.

Слайды ДНК-микрочипов часто называют генными чипами или ДНК-чипами. ДНК-чипы широко используются для параллельного профилирования тысяч генов. Помимо экспрессии генов, они также используются для изучения экспрессии микроРНК, количества копий ДНК и обнаружения однонуклеотидного полиморфизма. В коммерческих целях эти чипы используются в биотехнологии, криминалистике, токсикологии, разработке лекарств и таргетной терапии инфекционных и генетических заболеваний.

Химически стабильная природа ДНК-зондов делает ДНК-чипы самой популярной из технологий микрочипов. Ковалентно связанный одноцепочечный ДНК-зонд сохраняет свои нативные взаимодействия, несмотря на агрессивные химические вещества и температуры, которые используются при загрузке зонда и подготовке чипа.

Наиболее очевидным недостатком ДНК-микрочипов является наличие известной последовательности-мишени. Поскольку ДНК-микрочипы предназначены для дополнения целевой последовательности кДНК, последовательность мРНК, с которой копируется кДНК, должна быть известна. Это делает технологию непригодной для использования при поиске новых последовательностей мРНК. Для таких целей RNASeq является предпочтительным, хотя и дорогим вариантом.

Transcript

ДНК-микрочип содержит тысячи одноцепочечных зондов ДНК, расположенных в виде сетки на стеклянном или кремниевом чипе. Представляющая интерес ДНК флуоресцентно помечена и может гибридизоваться с комплементарным зондом на микрочипе.

Этот метод позволяет одновременно измерять относительные концентрации конкретных последовательностей кДНК.

Как правило, ДНК-микрочипы используются для количественной оценки экспрессии генов путем измерения уровней кДНК, соответствующих определенным транскриптам мРНК.

Другие области применения включают обнаружение связывания транскрипционных факторов на хроматине или идентификацию однонуклеотидных вариаций в геномной ДНК.

Микрочиповые зонды для измерения мРНК представляют собой одноцепочечные сегменты ДНК, соответствующие кодирующей области каждого гена, подлежащей анализу. Нуклеотиды зонда могут быть либо скопированы из геномной ДНК с помощью ПЦР, либо синтезированы непосредственно на поверхности чипа.

Эти зонды ковалентно прикреплены к чипу, образуя массив пятен, где каждый участок представляет собой одну мишень. Таким образом, один микрочип ДНК может анализировать десятки тысяч генов.

Для полногеномного анализа общее содержание мРНК выделяется из клеток организма и преобразуется в флуоресцентно меченые кДНК. Когда этот образец подвергается воздействию ДНК-микрочипа, зонды соединяются со своими комплементарными кДНК.

Флуоресцентный сигнал в каждой точке прямо пропорционален количеству связанной кДНК и может быть проанализирован соответствующим программным обеспечением для количественной оценки экспрессии генов.

Хотя этот анализ не дает абсолютных концентраций мРНК, он может быть использован для сравнения их относительных концентраций — следовательно, уровней экспрессии генов в двух образцах в разных условиях.

Эталонный образец может быть помечен зеленым флуорофором, в то время как тестовый образец будет помечен красным

Если тестовый образец имеет более низкую экспрессию, чем эталонный образец, то пятно отображается зеленым цветом, в то время как более высокое выражение обозначается красным пятном. Желтым цветом обозначены одинаковые уровни экспрессии в обоих образцах.