15.13: Секвенирование нового поколения

Секвенирование нового поколения — это собирательное название для группы технологий, которые могут способствовать относительно быстрому получению данных о последовательностях многих различных видов или групп особей.

Эти данные могут быть использованы для мелкомасштабной популяционной генетики или клинических исследований, и эти технологии быстрее и экономически эффективнее, чем традиционные методы секвенирования.

Существует множество методов секвенирования нового поколения, но, пожалуй, самым популярным является обратимое терминаторное секвенирование. Другие включают пиросеквенирование и секвенирование методом лигирования.

При обратимом секвенировании терминатора чистая геномная ДНК сначала разрезается на более мелкие фрагменты по 100-1000 пар оснований. Специальные адаптеры, которые представляют собой олигонуклеотидные последовательности с праймерными сайтами, затем лигируются к обоим концам этих фрагментов ДНК.

Затем одноцепочечные фрагменты ДНК загружаются на специализированный чип, называемый проточной ячейкой, который предварительно покрыт короткими олигонуклеотидными последовательностями, комплементарными адаптерным последовательностям. Фрагменты ДНК связываются с чипом через свои адаптеры.

На стадии амплификации ДНК-полимераза затем используется для синтеза комплементарной цепи ДНК. Двухцепочечная ДНК денатурируется, а исходный шаблон смывается.

Оставшаяся комплементарная нить затем изгибается и образует мостовидную структуру с помощью второго адаптера на другом конце.

Затем ДНК-полимераза может синтезировать комплементарную цепь изогнутой цепи ДНК — процесс, называемый амплификацией моста.

Двухцепочечный мост снова денатурируется для генерации линейной одноцепочечной ДНК, которая впоследствии может создавать новые мостики на чипе.

ДНК-полимераза продолжает эти циклы амплификации мостов, синтезируя тысячи копий фрагмента ДНК и приводя к образованию клональных кластеров.

Затем все обратные комплементарные цепи смываются с чипа, оставляя иммобилизованными только прямые нити ДНК.

Реакция секвенирования начинается с добавления ДНК-полимеразы модифицированных dNTP, помеченных четырьмя различными флуоресцентными метками. Эти dNTP также содержат 3′-блокирующую группу, называемую обратимым терминатором, которая позволяет добавлять только один dNTP за раз.

После каждого раунда добавления dNTP к растущей цепи чип визуализируется, и длина волны излучения от каждого кластера ДНК используется для идентификации основания.

Последовательность флуоресцентных изображений проточной ячейки, полученная после каждого добавления dNTP, используется для определения последовательности фрагментов ДНК.