32.10: Иммунопреципитация

Иммунопреципитация, или IP, является широко используемым методом, который использует взаимодействия белок-антитела для выделения белков или белковых комплексов в их нативном состоянии для изучения белок-белковых взаимодействий, четвертичных структур или супрамолекулярных комплексов. Обычно используются различные модификации метода, включая хроматин IP, сшивающий IP и флуоресцентный IP.

Иммунопреципитация хроматина

Иммунопреципитация хроматина, также известная как ChIP, используется для изучения взаимодействий белок-ДНК или белок-РНК. Это важный метод для изучения важнейших клеточных процессов, таких как транскрипция генов, репликация ДНК, рекомбинация и репарация, прогрессия клеточного цикла и эпигенетика. Также полезно определить in vivo расположение сайтов связывания различных факторов транскрипции, гистонов и других регуляторных белков.

Основными этапами ЦИП являются фиксация, ультразвуковая обработка, иммунопреципитация и анализ. Он включает в себя сшивание целевого белка с ДНК с помощью фиксирующего агента, такого как формальдегид, с последующей ультразвуком или ферментативным гидролизом для получения более мелких фрагментов хроматина. Затем в методе используются высокоаффинные антитела, специфичные против представляющего интерес белка, для захвата ДНК, связанной с белком, в реакции иммунопреципитации. Затем сшивание происходит в обратном направлении с использованием высокой температуры, высокой концентрации соли и протеиназы К для высвобождения ДНК из ассоциированных белков. ДНК дополнительно очищается, чтобы подготовить ее к анализу.

Сшивающая иммунопреципитация

Кросслинкинговая иммунопреципитация, или CLIP, идентифицирует участки сайтов связывания белков на эндогенной РНК путем их совместного осаждения в активной фазе транскрипции. Молекулы РНК сшиты с белками, чтобы крепко удерживать их вместе и предотвращать их деградацию. Процедура разбивки и изоляции комплексов аналогична ЧИП. Эта методика используется для изучения взаимодействия РНК с РНК-связывающими белками и их модификаций в различных биологических системах.

Ограничения ИС

Несмотря на то, что методы иммунопреципитации имеют тенденцию к сокращению количества этапов очистки, они имеют определенные ограничения. Антителосвязывающее рекомбинантные бактериальные белки, белки А или G, конъюгированные с агарозными шариками, и антитела, используемые в способе, могут подвергаться неспецифическому связыванию, внося контаминанты в очищенный белковый препарат. Кроме того, иммобилизация антител на бусинах требует оптимизации и является трудоемкой. Промывка шариков после создания комплекса антиген-антитело имеет решающее значение, но на этом этапе существует вероятность потери целевого белка.