33.4: Иммунофлуоресцентная микроскопия

Флуоресцентный микроскоп использует флуоресцентные хромофоры, называемые флуорохромами, которые могут поглощать энергию от источника света, а затем излучать эту энергию в виде видимого света. Флуорохромы включают в себя естественно флуоресцентные вещества (такие как хлорофиллы) и флуоресцентные красители, которые добавляются в образец для создания контраста. Такие красители, как техасский красный и FITC, являются примерами флуорохромов. Другие примеры включают красители нуклеиновых кислот 4′,6′-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и акридин оранжевый.

Микроскоп облучает образец коротковолновым возбуждением, таким как ультрафиолетовый или синий свет. Хромофоры поглощают возбуждающий свет и излучают видимый свет большей длины волны. Затем возбуждающий свет отфильтровывается (отчасти потому, что ультрафиолетовый свет вреден для глаз), так что только видимый свет проходит через линзу глаза, создавая изображение образца в ярких цветах на темном фоне.

Флуоресцентные микроскопы могут идентифицировать патогены, находить определенные виды в окружающей среде или находить местоположения определенных молекул и структур в клетке. Также были разработаны подходы, позволяющие отличить живые клетки от мертвых на основе того, поглощают ли они определенные флуорохромы. Иногда на одном и том же образце используется несколько флуорохромов, чтобы показать различные структуры или особенности.

Одним из наиболее важных применений флуоресцентной микроскопии является иммунофлуоресценция, которая используется для идентификации определенных микробов путем наблюдения за тем, связываются ли с ними антитела. (Антитела — это белковые молекулы, вырабатываемые иммунной системой, которые прикрепляются к определенным патогенам, чтобы убить или подавить их.) Этот метод имеет два подхода: прямой иммунофлуоресцентный анализ (DFA) и непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA). При ДФА специфические антитела (например, те, которые нацелены на вирус бешенства) окрашиваются флуорохромом. Если в образце содержится целевой возбудитель, то под флуоресцентным микроскопом можно наблюдать связывание антител с возбудителем. Это первичное окрашивание антител, потому что окрашенные антитела прикрепляются непосредственно к возбудителю.

При ИФА вторичные антитела окрашиваются флуорохромом, а не первичными антителами. Вторичные антитела не прикрепляются непосредственно к организму, а связываются с первичными антителами. Когда неокрашенные первичные антитела связываются с патогеном, можно наблюдать связывание флуоресцентных вторичных антител с первичными антителами. Таким образом, вторичные антитела присоединяются к возбудителю опосредованно. Поскольку несколько вторичных антител часто могут прикрепляться к первичному антителу, IFA увеличивает количество флуоресцентных антител, прикрепленных к образцу, что облегчает визуализацию его особенностей.