Мы опишем, как измерить возле мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в культуре астроцитов использованием полного внутреннего отражения и epifluorescence микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение Ближнего плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция в астроциты
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мозг содержит глиальные клетки. Астроциты, типа глиальных клеток, уже давно известно, обеспечивают пассивную вспомогательную роль для нейронов. Тем не менее, все больше данных о том, что астроциты также могут активно участвовать в функции мозга с помощью функциональной взаимодействия с нейронами. Однако, многие фундаментальные аспекты астроцитов биологии остаются спорными, неясными и / или экспериментально неизученными. Одним из важных вопросов является динамика внутриклеточного кальция в переходных астроцитов. Это важно, поскольку кальций хорошо известна как важный вторичный мессенджер и потому, что было предложено, что астроциты высотах кальция может вызвать выпуск передатчиков из астроцитов. Тем не менее, не было никакой детальной или удовлетворения описание около кальция плазматической мембраны сигнализации в астроциты. Полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия является мощным инструментом для анализа физиологически соответствующих сигнальных событий в течение приблизительно 100 нм плазматической мембраны живых клеток. Здесь мы используем TIRF микроскопии и описывают, как монитор вблизи плазматической мембраны и глобальной динамики внутриклеточного кальция почти одновременно. Дальнейшее уточнение и систематическое применение этого подхода есть потенциал, чтобы сообщить о точных деталях астроцитов сигнализации кальция. Детальное понимание астроцитов динамики кальция могут служить основой для понимания, если, как, когда и почему астроцитов и нейронов проходят кальций-зависимых функциональных взаимодействий.
Протокол
Экспериментальных процедур
Экспериментальная процедура состоит из двух основных частей, описанных в шаге мудрым образом ниже.
Часть 1: ПОДГОТОВКА ГИППОКАМПА астроцитов КУЛЬТУР
Короче говоря, смешанные гиппокампа астроцитов-нейрона культуры были подготовлены с использованием хорошо установленным протоколом 1,2,3. Мы оптимизировали процедуру для получения здорового культурного астроцитов. Все процедуры, перечисленные ниже, должны осуществляться в стерильных условиях, таких как капот ламинарного потока.
Подготовка покровных
- 22 мм покровные (VWR, 48380-068)
- Поли-D-лизин (PDL, Sigma P0899), аликвоты (1 мг / мл)
- Ламинин аликвоты (20 мкг / мл): добавить 49 мл стерильной воды до 1 мг / мл ламинин решение (Sigma L2020), убедитесь, 1,2 мл аликвоты и храните при температуре от -20 ° C
- Растворите PDL в стерильной воде (50 мкг / мл)
- Автоклав покровные, промыть стерильной водой и поместите в PDL (20 мл на 100 покровные). Оставить при комнатной температуре в течение ночи.
- Замените PDL стерильной водой (3 обширные моет). Затем сухие покровные и хранить при температуре 4 ° C.
- Накануне покрытие астроциты, место отдельных покровных в стерильных также на 6-луночного планшета (многоямного плоским дном пластины с крышками, стерильные с BD Bioscience). Положите 400 мкл ламинин на каждом покровное и инкубировать в течение ночи, в инкубаторе, чтобы избежать испарения.
Рассечение
Препарирование СМИ:
- Сбалансированный 500 мл Эрла раствор соли (EBSS) (1X), жидкие (Invitrogen, 14155-063)
- 5 мл HEPES решение (Sigma, H0887)
Гиппокампа СМИ:
- 412,5 мл минимально необходимого среднего (MEM) (1X), жидкость содержит солей Эрла, но не L-глютамин или фенол красный (Invitrogen, 51200-038)
- 10 мл глюкозы (Sigma, D-(+)-ГЛЮКОЗЫ БЕЗВОДНЫЙ SIGMA ULTRA G7528) 1 M в MEM
- 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
- 5 мл Натрия пируват решение (Sigma, S8636)
- 12,5 мл HEPES раствор 1 М (Sigma, H0887)
- 5 мл N-2 Дополнение (100X), жидкие (Invitrogen, 17502-048)
- 50 мл лошадиной сыворотки, тепло-инактивированная (Invitrogen, 26050-088)
Папаин решение:
- Добавьте 5 мл вскрытия средств массовой информации в Уортингтон папаин-022 флакона (LK003178; конечная концентрация 20 ЕД / мл) и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 60 мин.
- Обезглавьте крысят в возрасте P1 (обычно 2 щенка) следующие рекомендации проверены и одобрены национальными правилами и ваши местные институциональные уходу и использованию животных комитета.
- Удалить кожу и череп и мозг место в чашке Петри заполнены холодной СМИ рассечение.
- Удалены мозговых оболочек, рассекать обоих полушарий и рассекать гиппокампе.
- Чоп в гиппокампе ~ 1X1 мм кусочки и переварить в растворе папаина при 37 ° С в течение 11-13 мин.
- Как только кусочки ткани осели, удалить папаин осторожно и добавляют 5 мл гиппокампа среду, чтобы удалить все следы фермента. Повторите этот шаг и ресуспендируют в гиппокампе среде (2 мл).
- Измельченного в порошок клетки ~ 5 раз, пока Есть не сгустки слева, с тремя пламени полированный пипеток все меньшие отверстия (1000 мкм, ~ 500 мкм и ~ 300 мкм).
- После растирают, проходят клетки через ячейки сетчатого фильтра (размер пор, 70 мкм, BD Bioscience). Граф клеток в 10 мкл суспензии. Регулировка громкости гиппокампа средой, чтобы иметь 400 000 клеток / мл.
- Аспирируйте ламинин от покровных, а до крышки можно сухих, пластина 200 мкл суспензии клеток в покровное.
- Оставьте их приложить в течение 60 мин в инкубаторе, а затем добавить 2 мл гиппокампа среды на лунку.
- На следующий день, аспирации старые гиппокампа средой для удаления мертвых клеток и мусора и добавьте 2 мл подогретого свежего гиппокампа среды.
Обслуживание
Neurobasal СМИ:
- 500 мл neurobasal (Invitrogen, 12348-017)
- 10 мл сыворотки B27 бесплатное приложение (Invitrogen, 17504-044)
- 5 мл пенициллина, стрептомицина (Invitrogen, 15140-122)
- 1,25 мл L-глутамина (Invitrogen, 25030-149)
Поток астроцитов-нейрон культур два раза в неделю с neurobasal среды, начиная через четыре дня после металлизации. Preincubate СМИ около 30 минут в инкубаторе в вентилируемом колбу, чтобы уравновесить температуру и CO 2.
Часть 2: КАЛЬЦИЯ IMAGING
Гиппокампа буфера записи: 110 мМ NaCl, 5,4 мМKCl, 1,8 мМ CaCl 2, 0,8 мМ MgCl 2, 10 мМ D-глюкозы, 10 мМ HEPES (Все химические вещества из Sigma), рН 7,4 (регулируется с NaOH).
Загрузка красителя кальция индикатор в астроциты
- Место культуры в хорошо на 6-луночный планшет заполнен 2 мл гиппокампа буфера записи, содержащей 2,5 мкМ Fluo-4, А. М. (Invitrogen, F-14217) и 0,05% Pluronic ® F-127 20% раствор в ДМСО (Invitrogen, P-3000MP) и инкубируют при комнатной температуре в течение 10-30 мин.
- Удалить Fluo-4 решения и мыть покровные 3 раза гиппокампа буфера записи и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Место покровное на камеру, а чистая другой стороне покровного с объективом жидкости очистки.
- Положите одну каплю иммерсионного масла (погружение нефти типа DF с Cargille) на цель и поставить камеры (с открытой камерой на 25 мм выстрел покровное от Warner Instruments) на столик микроскопа (Olympus IX71).
- Посмотрите на клетки, используя пропускание света, чтобы увидеть, как выглядят клетки, и получить их в фокусе. Затем освещения клеток с 488 нм от монохроматора (полихромные V от до Vision) и определить, если сигнал флуоресценции от Fluo-4 является однородным и обнаруживается в астроциты.
- Используйте РПИ и TIRF освещения для измерения кальция в астроциты.
TIRF микроскопии
Одним словом, мы используем Olympus IX71 Микроскоп оснащен камерой Andor IXON DV887DCS EMCCD. Контроль возбуждения и захвата изображений достигается с помощью TILLVision программного обеспечения. Пучки 454/488/515 нм аргон (100 мВт) и 442 нм твердом состоянии (45 мВт) лазеры и управляться с ДО Polyline лазерной комбайнера, TIRF двойной конденсатор порт и acoustoptical настраиваемый фильтр и контроллер (AOTF, все из ДО Photonics) и подается в Kineflex широкие волокна полосы для вступления в конденсаторе TIRF. Мы используем Olympus 60X 1,45 NA линз для достижения TIRF. Усиление камеры настраивается для каждого астроцитов, чтобы обеспечить лучший сигнал-шум изображения. Фон и принципы микроскопии TIRF были недавно рассмотрели 4, 5. Большинство оптических компонентов мы используем были приобретены у ДО Photonics, которая сейчас является частью компании Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/). Глубина проникновения МДП может быть рассчитана по уравнениям ниже.
D = глубина проникновения
n1 = преломления стекла
n2 = преломления клеточных
= угол падения
NAi = числовой апертурой падения
В целях обеспечения лазерной выравнивается оптимально для TIRF мы находим его полезным для наблюдения 100 нм флуоресцентного шарик (Invitrogen, F8803). Мы представляем отдельные кадры и видео из бисера с РПИ и TIRF микроскопии. Когда в TIRF, наблюдается резкое увеличение сигнал-шум и бисером дисплей броуновской диффузии. Мы находим его полезным для наблюдения за поведением 100 нм бисер с TIRF микроскопии на регулярной основе (~ раз в неделю), чтобы убедиться, что оптимальное TIRF происходит, а не угрозу косом освещении, что может произойти, если критический угол не были равны α (см. рис 1).
Применение G-белком рецептор агонистов связаны
Астроциты выражать различные Gq-связанных рецепторов, 6, 7, включая метаботропных рецепторы глутамата и P2Y рецепторов (агонист, АТФ, АДФ). Активация этих рецепторов приводит к значительному увеличению внутриклеточного уровня кальция в астроциты. Например, нетрудно заметить внутриклеточного кальция высотах во время применения СПС (30 мкМ) на астроциты 8-10. Мы используем быстрое решение переключатель с Warner инструменты называют VC-77SP Быстро Шаг перфузии системы (http://www.warneronline.com/index.cfm). С помощью этого метода решения могут быть применены в менее ~ 10 мс.
Рисунок 1. Мультфильм и фотографии изображений создана. А. Показывает фотографию Микроскоп установлен на airtable, в то время (B) показывает фотографию лазерной установки, контроллеры и балки коробки. С. Показывает фотографию столике микроскопа с камеры установлены для работы с изображениями. На левом быстро устройство перфузии можно увидеть (наряду с шаговым двигателем и тета трубки). На правом headstage из усилителя Axopatch 200A не наблюдается. Мультфильм схематизирует пути света в настройке и как TМДФ достигается. Лазерной сосредоточено на задней фокальной плоскости 60X 1,45 NA объектива и его положение регулируется от центра так, что он возникает в иммерсионного масла в критический угол α. В этот момент луч испытывает полное внутреннее отражение и убывает с расстоянием λ (см. уравнение в основной текст) в среду меньшим показателем преломления. В данном случае это буфер записи окружающие астроциты и астроциты себя. В результате оптического возбуждения (и, следовательно, изображения) молекул с точностью до ~ 100 нм от плазматической мембраны. В мультфильме ячейки это показано в виде зеленых "возбужденным" мембранных рецепторов, тогда как в клетке или на верхней поверхности клетки не возбуждаются. Полный отчет о микроскопии TIRF была предоставлена Steyer и Алмерс 4.
Рисунок 2. Изображения 100 нм люминесцентные бусины, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. показывает EPI изображения поля зрения с несколькими десятками 100 нм флуоресцентные бусы. Красная точка стрелки бусы, которые поселились на стекло покровное, тогда как синие стрелки указывают на бусы, которые диффундируют в воде. Б. Шоу TIRF изображение одного и того же поля зрения, как показано на А. С этой точки зрения только приверженец бисером показаны красными стрелками видны. Это потому, что эти поселились на стекло coverlsip и, таким образом в течение ~ 100 нм затухающего поля. Бисер показано в по синим стрелкам, не в этом регионе и, таким образом, невидимые на изображениях TIRF. Ниже графики показывают 3D-рендеринга образов. Очевидно, что значительное увеличение отношения сигнал-шум происходит для бисера в затухающего поля при наблюдении с помощью микроскопии TIRF. На самом деле за этими изображениями сигнал-шум для РПИ составила 7,1 ± 0,6, тогда как для TIRF было 20 ± 0,7.
Рисунок 3. Изображения астроциты загружены Fluo-4 кальция индикатор красителя, приобретенного с РПИ и TIRF микроскопии. А. EPI изображения поля зрения с пятью астроцитов. Б. изображение TIRF одного и того же поля зрения показано на В. Отметим, что образы в А и В существенно различаются. Это потому что с TIRF освещения только плазматической мембраны регионах в тесном прикладывание к покровное стекло в образ будут включены. Нижней панели показывают АТФ-вызвали внутриклеточного кальция переходных полученную с РПИ и TIRF микроскопии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хорошо установлено, что астроциты дисплей внутриклеточного кальция высот. Это происходит спонтанно, может быть вызвана активность нейронов или с применением агонистов для активации рецепторов на поверхности астроцитов 11. Одним из важных и спорный вопрос, является ли астроцитов внутриклеточного кальция высоты может вызвать высвобождение сигнальных молекул, которые активируют рецепторы нейронов на 11, 12. Это спорный, потому что было доказательств за и против этой точки зрения, как это подчеркивается в обзорах Хейдон
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Эта работа была поддержана Уэхара Мемориальный фонд Японии (Е. С.), а также Уайтхолл Фонд Национального института неврологических расстройств и инсульта и Штайн-Оппенгеймера фонда премии (для БСК).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| VWR® Микроскопические покровные стекла, круглые, № 1 | Инструмент | VWR international | 48380-068 | |
| Поли-D-лизин гидробромид | Реагент | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Ламинин из базальной мембраны саркомы Энгельбрета-Хольма-Сворма мышей | Реагент | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Эрль’Сбалансированный солевой раствор Эрнстхайна-Хэнкса (EBSS) (1X), жидкий | Реагент | Invitrogen | 14155-063 | |
| Минимальная эссенциальная среда (MEM) (1X), жидкая, содержит раствор Эрла’соли, но без L-глутамина и фенолового красного | Реагент | Invitrogen | 51200-038 | |
| раствор пенициллина и стрептомицина | Реагент | Invitrogen | 15140-122 | |
| Раствор пирувата натрия | Реагент | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Раствор HEPES 1 M | Реагент | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Добавка N-2 (100X), жидкая | Реагент | Invitrogen | 17502-048 | |
| Сыворотка лошадиная, инактивированная нагреванием | Реагент | Invitrogen | 26050-088 | |
| ПАПАИН-022 | Реагент | Worthington Biochemical | LK003178 | |
| Neurobasal™ Среда (1X) жидкая без фенолового красного | Реагент | Invitrogen | 12348-017 | |
| Добавка B-27 без сыворотки (50X), жидкая | Реагент | Invitrogen | 17504-044 | |
| L-глутамин 200 мМ (100X), жидкий | Реагент | Invitrogen | 25030-149 | |
| Клеточные фильтры (стрейнеры) | Инструмент | BD Biosciences | 352350 | |
| Стерильные многолуночные планшеты BD Falcon с плоским дном и крышками | Инструмент | BD Biosciences | 353046 | |
| NaCl | Реагент | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Реагент | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| CaCl₂2 гексагидрат | Реагент | Sigma-Aldrich | 21108 | |
| MgCl₂2 гексагидрат | Реагент | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| HEPES в форме свободной кислоты | Реагент | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D-(+)-глюкоза | Реагент | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Раствор Fluo-4, AM 1 мМ в ДМСО | Реагент | Invitrogen | F-14217 | |
| Плюроник® 20% раствор F-127 в DMSO | Реагент | Invitrogen | P-3000MP | |
| Иммерсионное масло ТИПА DF | Микроскоп | Cargill Labs | 16242 | |
| Открытая камера для круглых покровных стекол диаметром 25 мм, 100 шт. μобъем | Инструмент | Warner Instruments | 64-0362 (RC-21BDW) | |
| Платформа P-2 для камер серии 20, без нагревателя | Инструмент | Warner Instruments | 64-0278 (P-2) | |
| микросферы FluoSpheres с карбоксильной модификацией, 0,1 μм, желто-зеленый флуоресцентный (505/515), 2% твердых веществ | Реагент | Invitrogen | F8803 |
Ссылки
- Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo. Nature Methods. 5, 87-93 (2008).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Nunez, J. Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats. J Vis Exp. 19, (2008).
- Steyer, J. A., Almers, W. A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).
- Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signalling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Haydon, P. G. GLIA: listening and talking to the synapse. Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks. J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes. J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).
- Agulhon, C. What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology. Neuron. 59, 932-946 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Lee, S. Y., Haydon, P. G. Astrocytic glutamate targets NMDA receptors. J Physiol. 581, 887-888 (2007).
- Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons. J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).
- Cahoy, J. D. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28, 264-278 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
