Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни на твердых средах

Краткое содержание

В этой статье мы представляем общий протокол для измерения продолжительности жизни нематод поддерживается на твердых средах с УФ-убил бактериальной пищи.

Аннотация

Старение является дегенеративный процесс характеризуется прогрессирующей деградации клеточных компонентов и органелл в результате чего смертность. Нематоды

Протокол

Часть 1: Подготовка нематоды питательной среды (НГО) плит

В этом разделе описывается подготовка твердые пластины NGM для использования в эксперименте продолжительность жизни. Основной эксперимент продолжительностью жизни требуется два типа плит: стандартные пластины NGM, не содержащие добавок и усилителей / ФУДР плиты, которые имеют как ампициллин (Amp) и fluorodeoxyuridine (ФУДР) добавлен в НГО. Ампициллин используется для предотвращения иностранного бактериального загрязнения. ФУДР подавляет деление клеток, уменьшает производство яиц, а также предотвращает яйца инкубационные. Использование ФУДР долголетия анализа не влияет на продолжительность жизни взрослых и устраняет необходимость передачи червей каждые несколько дней для того, чтобы отделить их от растущей личинки. Оба вида плит высевают с Е. OP50 кишечной бактерии, который впоследствии убит в результате воздействия УФ-излучения.

1. Подготовка НГО (см. раздел 5 по рецепту и хранения заметок) и пластины этикетке Петри. Вам понадобится 1 60 мм Петри пластины на 10 мл NGM. Если вы начинаете с заранее подготовленным твердых NGM, переходите к шагу 1.2. Если вы начинаете с только что автоклавного NGM, перейдите к шагу 1.4.
2. Полностью расплава твердых NGM в микроволновую печь на высоко в 30-секундных импульсов. Swirl СМИ между импульсами для предотвращения давления пузырьки газа из застройки.
3. Место жидкости NGM в 55 ° С водяной бане или на скамейке, чтобы охладиться.
4. После NGM достигает 55 ° С добавить 33 мкл 150 мМ ФУДР и 100 мкл 100 мг / мл ампициллина на 100 мл NGM (для Amp / ФУДР пластин) и вихрем перемешать. Для NGM пластины без дополнительных препаратов приступить непосредственно к шагу 1.5.
5. Использование стерильных, пипетка 10 мл NGM в каждую 60 мм пластины Петри. Избегайте образования пузырьков если это возможно. Если пузырьки делают вид, они могут быть очищен помощью кончика пипетки.
6. Оставьте пластин на скамье с крышками, чтобы NGM укрепить и сухой. Если возможно, оставьте тарелки на скамейке в течение 2 дней, прежде чем добавлять бактерии, но один день будет работать, если пластины необходимы раньше.
7. За день до пластин закончить сушку, семенной жидкости LB культуры с одной колонии из свежих полоса Е. OP50 кишечной бактерии на LB агар. Вы должны подготовить по крайней мере 1 мл ночь OP50 культуры на 60 мм пластины.
8. Место OP50 культуры в 37 ° C шейкере и позволяют бактериям расти в течение ночи (культура должна достигать насыщения).
9. Гранул OP50 бактерий вращается со скоростью 3500 г в течение 10 минут.
10. Удалить 90% супернатант и ресуспендируйте бактерий сосредоточиться культуры 10x.
11. Внесите 100 мкл 10x концентрированный OP50 культуры в центре затвердевшего пластин NGM. Swirl пластины аккуратно разложить культуру бактерий, если это необходимо (в идеале должна охватывать бактерий центральной площади NGM не приходя вблизи пластинки стен). Старайтесь не прикасаться кончиком пипетки к поверхности НГО, а недостатки в поверхность СМИ позволяют черви зарываются в НГО.
12. Оставьте пластин на скамейке ночь, чтобы позволить бактериям культуры сушить на твердом НГО (как правило, занимает около 24 часов).
13. После высыхания подвергайте поверхность пластины УФ дозы достаточно для ареста рост бактерий. Если вы используете Stratalinker Stratagene УФ-2400:
    • Место пластин в Stratalinker и снять крышки
    • Закройте дверь и включите Stratalinker
    • Пресса "Энергия"
    • Введите '9999 'с помощью клавиатуры
    • Нажмите кнопку 'Пуск'
    • Пластины будет подвергаться УФ в течение примерно 5 минут
14. Плиты с УФ-убитых бактерий могут быть сохранены с ног на голову при 4 ° С в течение 1 месяца.

Часть 2: Выполнение приурочен откладки яиц приобрести возрастных синхронизированы популяции животных

В этом разделе мы генерируем населения червей с общим люк в актуальном состоянии. Это достигается путем предоставления репродуктивно активных взрослых, чтобы отложить яйца на тарелке в течение определенного периода времени и позволяет эти яйца развиваться.

1. (Дополнительно) Перевод примерно 20 молодых червей взрослого свежие пластины NGM без ФУДР. Оставьте пластин при 25 ° С для того, чтобы черви для распространения и съесть через все бактериальной пищи. После бактериальных пищевых было потреблено только что вылупившихся червей войдет роста арестован Dauer стадии. Вы начнете видеть Dauer личинки вокруг в течение недели, в зависимости от того, сколько червей вы передаете к пластине на начальном этапе. Dauer личинки могут быть использованы для дальнейших шагов на срок до 1 месяца.
2. (Дополнительно) Перевод от 20 до 30 Dauer личинки к свежим пластины NGM без ФУДР. В присутствии пищи личинки Dauer станет репродуктивно активных взрослых в течение 2 дней и остаются репродуктивно активным в течение нескольких дней после этого при 25 ° C.
3. Передача от 10 до 15 репродуктивно активных взрослых на свежем пластины NGM без ФУДР. Эта пластинка называется прокладка приурочен яйцо (TEL) пластины.
4. Оставьте TEL пластины при 25 ° С в течение 6 часов, чтобы позволить тон червей время, чтобы отложить яйца.
5. Удалить взрослых червей из пластины TEL. Пластина может быть визуально проверены на яйца, прежде чем снимать взрослых. Если черви не заложили достаточное количество яиц, тарелка TEL можно оставить при температуре 25 ° С в течение в общей сложности до 24 часов, прежде чем снимать взрослых червей.
6. Место TEL пластины при температуре 20 ° С до яиц вылупились и червей разработали для L4 личиночной стадии (обычно это занимает от 2 дней для дикого типа C. Элеганс, но может занять больше времени для штаммов с медленным развитием фенотипы).

Часть 3: Оценка животных для жизни

В этом разделе мы следуем возрастных синхронизированы населения червей из ч. 2 до самой смерти. Черви ведутся на Amp / ФУДР пластины, чтобы предотвратить производство яиц и бактериального загрязнения и считаются мертвыми, когда они не реагируют на внешние раздражители.

1. Передача L4 личинке посеяны Amp / ФУДР пластин. Для каждого штамма или состояние проходит испытания, это характерно создать 2-3 пластин с 25-30 червей на чашку. Изображения C. Элеганс этапах жизни предоставляются при условии ссылки (рис. 1) ^1.
2. Место Amp / ФУДР пластин при 20 ° С в течение 24 часов.
3. После 24 часов, визуально оценить червей, средств массовой информации, и бактерии. Передача червей на свежий Amp / ФУДР пластинами, если любой из следующих наблюдается:
   • Черви съели большую часть бактериальной пищи. В начале жизни червей промежуток эксперимента должны быть переданы с 1 по 2 раза в неделю, чтобы предотвратить бактерии из истощаются.
   • Значительное количество личинок присутствуют. Как правило, это признак того, что черви были переданы Amp / ФУДР пластин, как молодые люди вместо того, чтобы L4S и смогли заложить несколько яиц до ФУДР вступил в силу. ФУДР обычно предотвратить личинок из растущих в полной взрослые, но иногда несколько вырастет на взрослых и стали путать с подопытными животными.
   • Live / растущих бактерий не наблюдается. Как правило, сочетание усилителя и УФ-убийство будет гарантировать, что не живые бактерии загрязняют эксперимент, но иногда это происходит.
   • Грибковые рост наблюдается на средства массовой информации. Если поймано достаточно рано, грибков обычно можно сократить с помощью кончика пипетки или шпателем. Как только оно растет, чтобы быть больше чем на несколько миллиметров в диаметре, как правило, легче перенести червей новой пластинкой.
   • Использование рассечение области, проверки соответствия каждой из червь живым или мертвым.
   • Аккуратно нажмите на пластину. Червь живым, если он движется в ответ на нажатия.
   • Если червь не реагирует на нажатия пластины, увеличить на области головы.
   • Аккуратно крана головы червя с платиной выбрать передачу. Оценка червь, как мертвые, если он не отвечает, перемещая голову.
   • Мертвые черви могут быть удалены из пластины.
4. Запись даты и количества червей, которые являются живыми и мертвыми.
5. Вернуться пластин до 20 ° C.
6. Повторите шаги с 3,3 по 3,6 каждые 2 до 3 дней, пока все черви умерли.

Часть 4: Представитель результаты.

Сырых данных, полученных в эксперименте промежуток жизни нематод список дат с соответствующим количеством червей, которые являются живыми и мертвыми для каждого штамма испытания. Количество червей, которые умирают каждый день, как правило, перевернутый рассчитать долю червей живое на каждый день (рис. 2А), которая построена графически в виде кривой выживаемости (рис. 2Б; день яйценоскость приурочен считается день 0 ). Продолжительность жизни для каждого отдельного червя в исследовании может быть рассчитана количество червей, которые умирают каждый день, и используется для расчета средней и средней продолжительности жизни для сравнения между штаммами. Подсчет количества живых червей на каждый день не используется непосредственно в жизни Анализ диапазона. Черви поддерживается на твердых средах будет время от времени 'бежать', или ползать либо на стену пластины или вниз под средствами массовой информации. Количество червей живое на каждый день может быть использована для определения количества червей бежали на протяжении всего эксперимента. Черви, которые бегут, как правило, удалены от анализа. В качестве ориентира, типичная средняя продолжительность жизни для N2, C. Элеганс штамма дикого типа, поддерживается на УФ-убитых бактерий при 20 ° С составляет около 25 дней, считая от яйца.

Часть 5: Решения

Нематоды Рост Медиа (НГО), 100 мл:
Комбинат:
0,3 г	NaCl
0,25 г	Пептон
2 г	Агар
Автоклав в течение 40 минут и дайте остыть до 55 ° С, затем добавить:
100 мкл	1 М MgSO 4
100 мкл	5 мг / мл Холестерин
100 мкл	1 М CaCl2
1,625 мл	1,5 М КПИ рН 6,0
Жидкие NGM могут быть использованы немедленно влить пластин или позволили укрепить и хранить долгосрочные при комнатной температуре

Отвар Лурия (LB), 1л:
10 г	BactoTryptone
5 г	Дрожжевой экстракт
10 г	NaCl
10 мл	1 М Трис рН 8,0
1 л	деионизированной воды
Автоклавы и хранить при комнатной температуре.

1 М MgSO 4, 300 мл:
73,95 г	MgSO 4
300 мл	деионизированной воды
Автоклавы и хранить при комнатной температуре.

5 мг / мл, холестерина, 200 мл:
1 г	холестерин
200 мл	100% этаноле
Фильтр стерилизуют и хранят при комнатной температуре.

1 М CaCl 2, 500 мл:
27,75 г	CaCl 2
500 мл	деионизированной воды
Фильтр стерилизуют и хранят при комнатной температуре.

1,5 М КПИ рН 6,0, 1 л:
Комбинат:
31,4 г	КПИ двухосновный
179,6 г	КПИ одноосновных
850 мл	деионизированной воды
Тепло, помешивая, чтобы KPI для растворения в раствор. Отрегулируйте рН до 6,0 с 10 н.
Добавить деионизированной водой до 1 л
Автоклавы и хранить при комнатной температуре.

1 М Трис, рН 8,0:
60,57 г	Трис
400 мл	деионизированной воды
Отрегулируйте рН до 8,0 с HCl.
Добавить деионизированной водой до 500 мл.
Фильтр стерилизуют и хранят при комнатной температуре.

150 мМ Fluorodeoxyuridine (ФУДР), 10 мл:
0,3693 г	ФУДР
10 мл	стерильной деионизованной воде
Хранить при -20 ° C.

100 мг / мл ампициллина (Amp), 10 мл:
1 г	Ампициллин
10 мл	стерильной деионизованной воде
Хранить при -20 ° C.

50 мг / мл Карбенициллин (карбонат), 10 мл:
500 мг	Карбенициллин
10 мл	стерильной деионизованной воде
Хранить при -20 ° C.

1 М Изопропиловый β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 мл:
2,38 г	IPTG
10 мл	стерильной деионизованной воде
Хранить при -20 ° C.

Рисунок 1. Яркие образы области С. Элеганс этапах жизни, включая яйца, четыре личиночные стадии (L1 - L4), и взрослым. Все панели показывают, гермафродиты, кроме правого нижнего, который показывает, взрослый самец (изображение из древесины (1988)).

Рисунок 2. Представителю результаты C. Элеганс жизни эксперимент сравнения дикий штамм N2 тип штамма содержащих мутации DAF-2 гена. (А) таблица, показывающая собранные данные, включая количество дней, прошедших с червями были яйца, число погибших червей наблюдается на каждый день, и процент от исходного образца оставшихся в живых на каждый день (как рассчитывается ежедневно рассчитывает мертвых червей) . (B) Выживание кривые, соответствующие жизни данных, представленных в (А).

Рисунок 3. Представителем сравнение липофусцина между молодыми и старыми взрослого C. Элеганс. Яркие образы поля, представлены на левой и DAPI канал флуоресцентные изображения справа. Топ панелей показать 4 день старого червя и нижней панелях шоу 11 день старого червя (на основании оценки яйцо).

Обсуждение

Генетического контроля долголетия хорошо изучена в C. Элеганс, во многом благодаря простоте и быстроте, с которой продолжительность жизни может быть определена. Протокол обсуждается в этой статье описываются основные рамки для получения воспроизводимых жизни данных на языке C. Элеганс, а также может быть применен к relatednematode видов. ² Делая несколько простых изменений этих процедур может быть адаптирован для измерения продолжительности жизни в различных условиях. Здесь мы обсудим нескол...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Агар	Реагент	Fisher Scientific	DF0145-17-0 (214530)
Ампициллин	Реагент	MidSci	0339
Бактотриптон	Реагент	Fisher Scientific	DF0123-17-3 (211705)
BactoPeptone	Реагент	Fisher Scientific	DF0118-17-0 (211677)
CaCl2	Реагент	Fisher Scientific	NC9699248 (1332-01)
Карбенициллин	Реагент	Gold Biotechnology	C0109
Холестерин	Реагент	Сигма-Олдрич	C75209
Фтордезоксиуридин (FUDR)	Реагент	Сигма-Олдрич	F0503
Изопропил β-d-Тиогалактопиранозид (IPTG)	Реагент	Gold Biotechnology	I2481C5
KPi Dibasic	Реагент	Fisher Scientific	5087862 (3252-01)
KPi Monobasic	Реагент	Fisher Scientific	5087861 (3246-01)
MgSO4	Реагент	Fisher Scientific	NC9561800 (2500-01)
NaCl	Реагент	Fisher Scientific	S251
Трис	Реагент	Сигма-Олдрич	T1503
Дрожжевый экстракт	Реагент	Fisher Scientific	DF0886-17-0 (288620)