Методическая статья

Высокой пропускной метод глобально исследования морфологии органелл в CEREVISIAE С.

DOI:

10.3791/1224

⸱

2 марта 2009 г.

 ,  , 
1Department of Cellular and Physiological Sciences, University of British Columbia - UBC

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GFP-синтез белков широко используется для визуализации органелл с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, скрининг на мутации, которые влияют на морфологию органелл как правило, требует отдельного мутагенеза и занимает много времени. Здесь мы демонстрируем метод одновременно включить органелл-GFP маркеров в почти 5000 несущественные генов у дрожжей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокая пропускная способность методов для изучения локализации белка или органелл морфологии является эффективным инструментом для изучения белковых взаимодействий и может помочь в достижении полного понимания молекулярных путей. В CEREVISIAE Saccharomyces, с развитием несущественные массив удаления гена, мы можем глобально исследования морфологии различных органелл, как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии использованием GFP (или вариант)-маркеров в разных слоев гена. Однако, включив GFP маркеров в каждом отдельном мутант отдельности трудоемкий процесс. Здесь мы описываем процедуры, которая обычно используется в нашей лаборатории. С помощью роботизированной системы для обработки с высокой плотностью дрожжей массивы и методы препарат выбора, мы можем значительно сократить время, необходимое и повышения воспроизводимости. Короче говоря, мы пересекаем GFP с метками митохондриального маркера (Apc1-GFP), чтобы с высокой плотностью массива 4672 несущественные мутантов удаления гена роботов реплики пиннинга. Через диплоидных отбора, спорообразование, прорастание и двойной выбор маркера, мы возвращаемся обоих аллелей. В результате, каждый гаплоидных одного мутанта содержит Apc1-GFP включены в его геномной локуса. Теперь мы можем изучить морфологию митохондрий во всех несущественных мутант фоне. С помощью этой высокой пропускной подход, мы можем удобно изучать и определять пути и гены, участвующие в наследство и образования органелл генома обстановке.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Материалы и методы:

  1. Дрожжи штаммов:
    • Acp1-GFP (GFP:: Его): С-концевой GFP-маркировка Acp1 был сгенерирован ПЦР-опосредованной гомологичной рекомбинации использованием плазмиды pKT128 (содержит GFP и HIS5). Положительные трансформанты были подтверждены конфокальной микроскопии и колонии PCR. Напряжение фона BY7043 (MAT альфа can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) из лаборатории Бун (Tong и Бун, 2006).
    • Удаление Мутант Array (DMA) (ххх:: KanR): она представляет собой массив из примерно 5000 удаление мутантов несущественные генов. Все эти несущественные генов были выбиты на G418. Напряжение фоне массива BY4741 (МАТА his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Наши DMA была родом из Бун лаборатории.
  2. Включение Acp1-GFP в DMA:

    Следующий протокол для принятия GFP массив адаптировано из синтетического генетический анализ (SGA) технологии (Tong и Бун, 2006) с изменениями. Все реплики шаги пиннинга делается с помощью Певица РОТОР высокой плотности arraying роботизированной системы. Кроме того, ручной фиксации или жидкой основе высокой плотности arraying робот может быть использован.

    Сокращения: YPD, дрожжевой экстракт, пептон-глюкоза, SD, синтетические отсева; ЗРК, Лю / Arg / Lys отсева информации; LHRK, Лю / Его / Arg / Lys отсева СМИ

    Подготовка
    1. Вырастить газон Acp1-GFP клетки при заливке 5 мл ночь Acp1-GFP культуры на YPD пластины. Разрешить пластине высохнуть достаточно пламенем или в биологических вытяжной шкаф.
    2. Инкубируйте планшет при 30 ˚ С в течение ночи.
    3. Использование робота, массив Acp1-GFP перелить в 1536 колоний на чашку. В то же время, подготовить новую копию DMA на реплику пиннинга к YPD + G418 пластин.
    4. Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.

      Спаривание и диплоидных выбор

    5. Мате Acp1-GFP штамма с DMA на реплику пиннинга и более прокладки колонии на YPD пластин.
    6. Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.
    7. Реплика пластины колоний на SD - Его G418 + пластины, чтобы выбрать диплоидных клеток (МАТА / MATalpha).
    8. Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.

      Sporulationg и прорастание

    9. Реплика пластины диплоидных колоний на расширение медиа споруляции, который содержит снижение уровня углерода и азота источников, чтобы вызвать образование мейоза спор.
    10. Инкубируйте пластин при 25 ˚ С в течение минимум 5 дней.
    11. Прорастают МАТА мейоза потомства от реплики-покрытие колоний на ЗРК СМИ и инкубировать пластин при 30 ˚ С в течение двух дней.
    12. Этот носитель будет стимулировать прорастание гаплоидных клеток из спор. С LUE2 рамки считывания открытия (ORF) интегрируется в Мата-промоутер конкретных STE2, все гаплоидов проросшие будет Мата.

      Выбор обоих аллелей

    13. Теперь необходимо выбрать оба аллеля GFP и один мутантный аллель. Чтобы достичь этого, Мата клетки реплики покрытием на ЗРК + G418 СМИ, которые выбирает для гаплоидные клетки, которые несут ген удаления (ххх:: kanR).
    14. Инкубируйте пластин при 30 ˚ С в течение ночи.
    15. Наконец, МАТА мейоза потомства являются репликой покрытием на LHRK + G418 средств массовой информации, чтобы выбрать для роста одиночных мутантов (ххх:: kanR) также укрывательство Acp1-GFP (GFP:: Его). Эти плиты можно хранить при 4 ˚ C в течение 3 месяцев.


    Следующий протокол для принятия GFP массив адаптировано из синтетического генетический анализ (SGA) технологии (Tong и Бун, 2006) с изменениями. Все реплики шаги пиннинга делается с помощью Певица РОТОР высокой плотности arraying роботизированной системы. Кроме того, ручной фиксации или жидкой основе высокой плотности arraying робот может быть использован.

    Сокращения: YPD, дрожжевой экстракт, пептон-глюкоза, SD, синтетические отсева; ЗРК, Лю / Arg / Lys отсева информации; LHRK, Лю / Его / Arg / Lys отсева СМИ

    Подготовка
  3. Микроскопия:
    1. Выберите желаемую мутант (ы), выражающая Acp1-GFP непосредственно из пластины.
    2. Рост клеток при 30 ° С в YPD или SD - Его средства массовой информации до начала фазы журнала.
    3. Визуализация с помощью конфокальной микроскопии с использованием GFP filterset. Примером ожидаемый результат показан на рисунке 1.

SGA СМИ:

Питательной среды (YPD) и выборе носителя (SD), используемые в настоящем протоколе обычно используется в дрожжах молекулярной биологии. Пожалуйста, обратитесь к методам в дрожжи (Амберг и соавт., 2005) для подробного описания.

ЗРК, LHRK СМИ (на 400 мл общего числа)

Добавить в заказ Количество
Дрожжи азотистого основания сульфатом аммония 2,7 г
Аминокислотасмесь 0,8 г
Агар 8 г
дН 2 O 360 мл
Автоклав
20% раствор глюкозы 40 мл
Остудить до 65 ˚ C
100 мг / мл canavanine 0,2 мл
100 мг / мл thialysine 0,2 мл
Смешать, залить 50 мл на чашку

ЗРК, LHRK + G418 СМИ (на 400 мл общего числа)

Добавить в заказ Количество
Дрожжи азотистого основания, без сульфата аммония 0,7 г
Amino смесь кислоты 0,8 г
Глутамат натрия 0,4
Агар 8 г
дН 2 O 360 мл
Автоклав
20% раствор глюкозы 40 мл
Остудить до 65 ˚ C
100 мг / мл canavanine 0,2 мл
100 мг / мл thialysine 0,2 мл
200 мг / мл G418 0,4 мл
Смешать, залить 50 мл на чашку

Обогащенный споруляции СМИ (на 400 мл общего числа)

Добавить в заказ Количество
Калия ацетат 4 г
Дрожжевой экстракт 0,4 г
Декстроза 0,2 г
Плодоношение аминокислот смеси кислот 0,04 г
Агар 8 г
дН 2 O 360 мл
Автоклав
Остудить до 65 ˚ C
200 мг / мл G418 0,4 мл
Смешать, залить 50 мл на чашку

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод может помочь эффективно включать митохондриального маркера, Acp1-GFP в различных мутантов фонов. Она основана на использовании роботизированной системы, и может быть легко принята для использования с любыми роботизированной системы. Эта процедура может также использоваться для включения других типов маркеров. Например, для визуализации ER, мы обычно используем маркер Erg11-GFP. В наш представитель изображений, мутанта и дикого типа с Acp1-GFP производителя были visualiz ред помощью конфокальной микроскопии дл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (грант 31/C15982), канадского института исследований в области здравоохранения, Канада Фонд инноваций, знаний британской Колумбии Фонд развития, Майкл Смит Фонда медицинских исследований (грант на CJR Лоуэн), и бороться за зрение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Среды для SGAСреды для культивирования (YPD) и синтетические среды с выпадением нутриентов (SD), включая LRK и LHRK, а также обогащенные среды для споруляции, используемые в данном протоколе, являются стандартными в молекулярной биологии дрожжей. Подробные описания см. в руководстве Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).
  2. Tong, A. H., Boone, C. Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFPessential

Похожие статьи