Всего монтирования в гибридизация является одним из наиболее широко используемых методов в биологии развития. Здесь мы представляем высоким разрешением двумя люминесцентными на месте протокол гибридизации для анализа точных выражению одного гена и для определения перекрытия выражение доменов двух генов. Мы включаем пропидий йодида ответного ядерного пятно, чтобы выделить ткани организации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Данио рерио Всего горе высокого разрешения двумя люминесцентными В Ситу Гибридизация
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Всего горе
Протокол
1. ФИКСАЦИИ
- Fix эмбрионов в течение ночи при 4 ° С с 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
- Удалить исправить и мыть 2 х PBS, 5 минут при комнатной температуре (RT).
- Вручную dechorionate эмбрионов в PBS в стеклянную пластинку депрессии использованием часовщик пинцетом. После dechorionation, эмбрионы, переданные с помощью пожарной полированное стекло пипетки Пастера, как они могут прилипнуть к полипропилена пипеток.
- Передача эмбрионы через серию 25%, 50% и 75% метанола в PBS в течение 5 минут каждый.
- Замените жидкость со 100% метанола, инкубировать 5 минут, а затем заменить свежим метанолом.
- Место эмбрионов при т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, представленные здесь хорошо работает с зондов, которые дают чистый сильный сигнал после окрашивания в течение 30-45 минут в обычной щелочной фосфатазы-опосредованной реакции. Перед выполнением флуоресцентные на месте протокол гибридизации, мы всегда проверяем наши зонды используя стандартный без флуоресцентного протокола (при условии, в дополнительный материал вместе с протоколом синтеза зонда). Мы имели меньший успех с люминесцентными на месте протокол гибридизации при использовании зондов слабее, но это може.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотели бы отметить вклад Dorthe Юлих, Дженнифер Круглый и Андрей Мара в разработке этого протокола. Исследования поддержки со стороны NICHD, Американского онкологического общества и марте Dimes.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 16% раствор параформальдегида, для ЭМ | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Развести до 4% в 1,33x PBS (конечная концентрация 1x). Хранить аликвотами по 2ml при –20°C |
| Протеиназа K, рекомбинантная, для ПЦР | Roche Group | 03115879001 | Приготовить рабочий раствор 20mg/ml в воде. Хранить аликвотами по 1ml при –20°C |
| Блокирующий реагент | Roche Group | 11096176001 | Приготовить 10% стоковый раствор в 1x малеиновом кислотном буфере. Хранить аликвотами по 50ml при –20°C. Стабилен при многократном замораживании и размораживании. |
| Анти-флуоресцеин-POD, Fab-фрагменты | Roche Group | 11426346910 | Разлить на аликвоты и хранить при -20°C. Одну рабочую аликвоту хранить при 4°C. |
| Анти-дигоксигенин-POD, Fab-фрагменты | Roche Group | 11207739910 | Как указано выше. |
| Система TSA Plus Fluorescein | PerkinElmer, Inc. | NEL741001KT | Готовить каждый флакон реагента TSA непосредственно перед использованием. Растворить в 60μl DMSO. Хранить при 4°C. |
| Система TSA Plus Cyanine5 | PerkinElmer, Inc. | NEL745001KT | Как указано выше |
| Система TSA Plus Cyanine3 | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT | Как указано выше |
| Набор TSA №16 тирамид AlexaFluor647 (включая HRP-козий анти-кроличный IgG) | Molecular Probes, Life Technologies | T20926 | Растворить тирамидный реагент в 150μl DMSO, разлить на аликвоты и хранить при –20°C. |
| RNase, DNase free (без РНКаз и ДНКаз) | Roche Group | 11119915001 | Поставляется в виде раствора 500μg/ml |
| Пропидий иодид | Molecular Probes, Life Technologies | P-3566 | Поставляется в виде раствора 1mg/ml в воде. |
Ссылки
- Schulte-Merker, S., Ho, R. K., Herrmann, B. G., Nüsslein-Volhard, C. The protein product of the zebrafish homologue of the mouse T-gene is expressed in nuclie of the germ ring and the notochord of the early embryo. Development. 116, 1021-1027 (1992).
- Jowett, T.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
