Мышь надпочечников сотовый хромаффинных Изоляция

Краткое содержание

Надпочечников медуллярного хромаффинных системах клеточных культур являются чрезвычайно полезными для изучения возбуждения секреции связи в в создании пробирке. Этот протокол иллюстрирует метод, используемый для рассекать надпочечников, а затем изолировать медуллярного регионе избавлением от коры надпочечников. Переваривание мозга в одиночных камерах хромаффинных затем продемонстрирована.

Аннотация

Надпочечников медуллярного хромаффинных системах клеточных культур являются чрезвычайно полезными для изучения возбуждения секреции связи в в создании пробирке. Этот протокол иллюстрирует метод, используемый для рассекать надпочечников, а затем изолировать медуллярного регионе избавлением от коры надпочечников. Переваривание мозга в одиночных камерах хромаффинных затем продемонстрирована.

Протокол

Сокращения:
РДЦ - надпочечников хромаффинных клеток, Е. Soln - раствор фермента, Е. DMEM - Обогащенный Дульбеко изменения Eagle среднего

1. Подготовка
   1. Добавить папаин, чтобы желаемое количество E. Soln (40 единиц папаин / 1 мл Е. Soln.).
   2. Активировать папаин с карбогена в течение приблизительно 15 минут на льду. Кислородом Локка буфера на льду, а также.
      
2. Рассечение
   1. Используйте 8-10 недель мыши.
   2. До пищеварения удалить кислородом буфера Локка и место на льду.
   3. Смотрите видео для вскрытия процедуры.
   4. Как только вырезали, место желез кислородом буфера Локка.
      
3. Подготовка железы
   1. Удаление жира из железа.
   2. Газа коры из железа.
      
4. Ферментативного пищеварения
   1. Стерильный фильтр кислородом папаин.
   2. Сделайте четыре бассейна кислородом папаин на чашке Петри.
      1. 3 бассейна должна быть около 100uls.
      2. 1 из бассейнов должна быть около 400uls.
   3. Вымойте medullae через бассейны
      1. С 1 по 3 100 мкл бассейнов.
      2. Затем через 400ul бассейн
      3. Pippette 300ul Е. Soln и мозгового вещества отрывки из 400ul бассейн в микроцентрифужную трубки.
      4. Qrap парафильмом и отцентрифугировать трубки и места в 37 ° С на водяной бане 20 минут.
      5. Помните продолжать кислородом оставшиеся Е. Soln содержащие папаин.
      6. Через 20 минут стерильный фильтр более Е. Soln.
      7. Замените старые Е. Soln купания medullae с вновь фильтруются Е. Soln.
         
5. Triturations
   1. Аспирацию и отбросить Е. Soln.
   2. Вымойте medullae в 1 мл Е. DMEM.
   3. Аспирацию и отбросить Е. DMEM.
   4. Добавить 300ul Е. DMEM и растирают с 20-кратным 1мл чаевые.
   5. Вырезать 200ul кончик стерильным лезвием бритвы.
   6. Измельченного в порошок 5-10X с вырезом наконечник 200ul.
   7. Отменить Е. DMEM части купания medullae. Средний будет содержать мусор.
   8. Добавить 300uls свежие Е. DMEM к medullae штук.
   9. Растирают с 200ul наконечник 20x
   10. Pippette Е. DMEM к микроцентрифужную трубки withough medullae штук. Средний будет содержать свободный РДЦ.
   11. Добавить 300uls свежие Е. DMEM к medullae штук.
   12. Измельченного в порошок medullae с 23,5 калибр иглы шприца 20x.
   13. Комбинат Е. DMEM с обеих triturations. Medullae частей не должна присутствовать и должны теперь иметь featherlike внешний вид.
       
6. Обшивка
   1. Микроцентрифужную Е. DMEM из последних двух растиранием шаги по 2,5 минуты на 3.7g s.
   2. Ресуспендируют пеллет в 50uls-200 Е. DMEM, в зависимости от последующих экспериментах.
   3. Пластина 10-30uls на покровное стекло.
   4. Подождите 15 минут для клеток придерживаться.
   5. Добавить 750uls Е. DMEM.