Окрашивание белков в гелях Кумасси G-250 без органических растворителей и уксусной кислоты

Краткое содержание

Короткий протокол для белка окрашивание Кумасси бриллиантовый синий (CBB) G-250 в полиакриламидном геле описывается без использования органических растворителей или уксусной кислоты, как в классической процедуры окрашивания CBB.

Аннотация

В классической белка окрашивания протоколы с использованием Кумасси бриллиантовый синий (CBB), растворы с высоким содержанием токсичных и горючих органических растворителей (метанол, этанол или 2-пропанол) и уксусную кислоту используют для фиксации, окраски и destaining белков в геле после SDS -PAGE. Чтобы ускорить процедуру, отопление окрашивание раствора в микроволновой печи в течение короткого времени часто используется. Это обычно приводит к испарению токсичных или опасных метанол, этанол или 2-пропанол и сильный запах уксусной кислоты в лаборатории, которых следует избегать из-за соображений безопасности. В протокол, который был опубликован в двух патентных заявок Е. М. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (В1)), альтернативный состав окрашивание раствора описывается, в которых не органическим растворителем или кислотой. CBB растворяют в бидистиллированной воде (60-80мг в CBB G-250 на литр) и 35 мМ HCl добавляется как только другие соединения в красящим раствором. Staning CBB геля осуществляется после SDS-PAGE и тщательное мытье геля в бидистиллированной воде. При нагревании гель во время стирки и окрашивания шаги, процесс может быть завершен быстрее и не токсичных или опасных compunds испаряются. Окрашивание белков происходит уже в течение 1 минуты после нагрева геля в красящим раствором и полностью разработаны через 15-30 мин с немного синего фона, обесцвечивают полностью длительное мытье окрашенных геля в бидистиллированной воде, без ущерба для окрашенных белков полосы.

Протокол

Часть 1: подготовка решения окрашивания CBB

1. 60-80 мг CBB G-250 растворяют в 1 литре бидистиллированной воды при перемешивании в течение 2-4 часов. Наконец, 3 мл концентрированной соляной кислоты добавляется в темно-синий раствор при перемешивании в течение другой минуты и хранить в темном месте для дальнейшего использования. Решение может храниться в течение недели до нескольких месяцев, не теряя своей эффективности окрашивания.
2. Концентрированная HCl должны быть обработаны с обычным унд ухода используется под вытяжкой. Окончательное решение будет около рН 2, так что перчатки должны использоваться и любой контакт с кожей следует избегать.

Обсуждение

• Промывки имеют решающее значение для эффективного окрашивания белков. Сократить время стирки ниже 2 мин или уменьшается объем воды (<50 мл) может привести к голубой белковых полос, скорее всего, за счет повышения количества остаточного SDS в геле.
• Если белки будут проанализированы масс-спектрометрии, отопления шаги в микроволновой печи должна быть пропущена, то время для мытья гелем продлен до 10 минут в каждом шаге и окрашивание времени продлен до интенсивности полосы достаточно сильна . Отопление геля приводит к сшивке б.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Кумасси бриллиантовый синий G-250	AppliChem	A3480	также может быть использован любой другой CBB G-250
Концентрированная HCl