Методическая статья

Получение высокоочищенного Toxoplasma гондий Ооцист по разрывным градиентом цезия хлорид

15.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1420

⸱

3 ноября 2009 г.

 ,  ,  , 
1Dynamac, Inc., 2Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, McMicken College of Arts and Science, 3Animal Parasitic Disease Laboratory, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 4National Exposure Research Laboratory, US Environmental Protection Agency

В этой статье

Краткое содержание

Данное исследование описывает развитие CsCl изменение метода, который легко очищается Т. гондий ооцист с фекалиями инфицированных кошек, которые подходят для молекулярно-биологических и манипуляции культуре ткани

Аннотация

Toxoplasma гондий является облигатным внутриклеточным патогеном простейших, которые обычно заражает людей. Она также характеризуется apicomplexan связанных с причинением вспышки пищевых и водных болезни. Окончательным хозяином является кошачьих, где сексуальное репликации в результате развития очень заразным и экологически устойчивых ооцисты. Заражение происходит через употребление ткани кисты от зараженного мяса или ооцист из почвы или воды. Инфекция, как правило, протекает бессимптомно у здоровых людей, но и приводит к пожизненной латентной инфекции, которая может активировать вызывая toxoplasmic энцефалита и смерти, если человек становится ослабленным иммунитетом. Мясо загрязненных Т. гондий кист были основным источником инфекции в Европе и США, но последние изменения в области управления животными и животноводство практики и улучшенной обработки пищевой и перерабатывающей процедуры привели к значительному сокращению распространенности Т. гондий кисты в 1 мясом, 2. Тем не менее, распространенность у людей остается относительно высоким том, что воздействие от ооцист загрязненной почвы или воды, скорее всего. Действительно, воду вспышки токсоплазмоз были зарегистрированы по всему миру поддерживают теорию воздействия экологических форму ооцисты представляет значительный риск для здоровья 3-5. На сегодняшний день исследований по пониманию распространенности Т. гондий ооцист в воде и окружающей среде ограничены из-за отсутствия инструментов для обнаружения ооцист в окружающей среде, 5, 6. Это в первую очередь из-за отсутствия эффективных протоколов очистки для получения большого количества высокоочищенного Т гондий ооцист от инфицированных кошек для исследовательских целей. Данное исследование описывает развитие CsCl изменение метода, который легко очищается Т. гондий ооцист с фекалиями инфицированных кошек, которые подходят для молекулярно-биологических и культуры тканей манипуляции 7.

Протокол

1. Общие меры безопасности при работе с Т. гондий Ооцист

  1. Важно соблюдать все правила техники безопасности при работе с Т. гондий Ооцист. В большинстве здоровых людей, Т. гондий Инфекция легко контролируется иммунной системой, однако пожизненное результаты инфекции. Иммунодефицитом люди особенно чувствительны к токсоплазмоз и не должны обращаться Т. гондий Ооцист. Беременные женщины также не должны обрабатывать Т. гондий Ооцист, так как инфекция может вызвать серьезные врожденные дефекты 8.
    2. Т. гондий Ооцист должны выполняться только в указанном месте и с обученным персоналом. Знаки, указывающие Т. гондий Ооцисты ведется работа должны быть вывешены для предупреждения других ввода назначенный район.
  2. Использовать соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), таких как лабораторный халат, одноразовые халат, одноразовые перчатки, и надлежащей защиты глаз или щиток для лица при обращении с Т. гондий Ооцист.
  3. Частая смена перчаток рекомендуется. Не справиться с любой лабораторного оборудования с Т. гондий Ооцисты загрязненные перчатки.
  4. Всегда использовать металлические лотки автоклавируемый выложены одноразовых абсорбирующих лайнеров при работе с Т. гондий Ооцист. Убедитесь, что все стеллажи, трубы и т.д., используемых либо одноразовые или автоклаве.
  5. Все Т. гондий Отходы должны обрабатываться в автоклаве в два раза, по крайней мере один час.
  6. Все не одноразовое оборудование (стеллажи, лотки и т.д.) также должны быть автоклавного два раза в течение не менее одного часа.
  7. Вакуумные линии, используемые для аспирации жидкостей должны быть подключены к Vacushield ™ фильтр для предотвращения загрязнения вакуумного насоса.
  8. Все пострадавших лабораторном столе-топы должны быть продезинфицированы после завершения работы с Т. гондий Ооцист. Только что составил 10% гипохлорита должны быть применены к либерально рабочей зоне и позволил сухой. Область должна быть хорошо промыты водой.

2. Подготовка буферов и растворов

  1. Подготовка 1 л 2,2 М раствора сахарозы путем растворения 752,66 г сахарозы в 600 мл DDH 2 О. Перемешать и тепло мягко использованием нагретой пластине размешать, чтобы растворить сахарозу. После полного растворения, довести объем до 1 л с DDH 2 О. За этим должно последовать путем стерилизации в автоклаве решение, по крайней мере 20 минут.
  2. Подготовка 1L ТЕ буфера (50 мМ Трис-HCl, 10 мМ ЭДТА), рН 7,2, добавляя 6,05 г трис-HCl и 3,7 г ЭДТА в 700 мл DDH 2 О, регулировать рН до 7,2 затем довести объем до 1 л с DDH 2 О.
  3. Для CsCl градиент, готовят исходный раствор CsCl с удельным весом 1,15 (1,15 CsCl) путем добавления 21,75 г CsCl с 103,25 мл буфера ТЕ. Для решения, смешать 30 мл TE с 20 мл 1,15-CsCl. Для решения B, смешать 20 мл TE с 30 мл 1,15-CsCl и 12,5 мкл смеси фенол красный раствор. Для решения C, смешать 10 мл TE 40 мл 1,15-CsCl (табл. 1).
  4. Подготовка 1L 1 N раствор гидроксида натрия (NaOH), растворив 40 г NaOH в 800 мл DDH 2 О. После растворения, довести объем до 1 л с DDH 2 О.
  5. Подготовка 1 L 2% (по объему) раствора H 2 SO 4 Смешивания 20 мл H 2 SO 4 С 980 мл DDH 2 О.

3. Сахароза плавать

  1. Добавить 10 мл фекальные приостановление Т. гондий Ооцист, в 2% H 2 SO 4, В 50 мл коническую трубку центрифуги. Следует отметить, что фекальные подвески относится к образцам, которые были предварительно обработаны с помощью процедуры флотации сахарозы, как описано выше 8. Когда фекальных образцов, первоначально найденным на зараженном кошек они обрабатываются с помощью сахарозы плавать, как описано в работе 8. Этот дополнительный поплавок сахарозы необходимо для дальнейшей минимизации фекальные мусора перенесены на CsCl процесс очистки и получения чистейшей Т. гондий Ооцист возможно.
  2. Нейтрализовать 2% H 2 SO 4 Путем добавления 6 мл (3 / 5 томов) в 1 N NaOH в фекальной суспензии. Хорошо перемешайте на вортексе.
  3. Добавить равный объем (16 мл) в 2,2 М сахарозы создания конечной концентрации 1,1 М фекальные подвеска и хорошо перемешать на вортексе.
  4. Осторожно наложения сахарозы / фекальные подвеска с 10 мл DDH 2 Вывод, используя 10 мл пипетки. Центрифуга подвески на 1200 мкг в течение 20 мин при комнатной температуре без тормозов.
  5. Осторожно собрать топ воды и межфазных слоев и переход на новый 50 мл коническую трубку центрифуги с помощью пипетки с воздух-вода без закрученного пипетки. Важно, чтобы свести к минимуму сахарозы переходящий во время сбора межфазного слоя.
  6. Mix оставшиеся сахарозы / фекальные решение пули в вортексе трубки.
  7. Повторите шаги 3.4 и 3.5.
  8. Принесите объемом два решения ооцисты межфазного до 50 мл DDH 2 O и центрифуги трубы на 2000 мкг в течение 10 минут при комнатной температуре.
  9. Аспирируйте супернатант из каждой пробирки и ресуспендируйте гранулы с 5 мл ТЕ-буфера и бассейн ооцисты подвески вместе. Общий объединенный объем должен быть 10 мл.

4. CsCl градиент

  1. Подготовка разрывных CsCl градиент в 50 мл поликарбоната трубки Ок-Ридж, тщательно нижележащих каждый слой с помощью 50 мл шприц с 18 калибра тупыми концами, автоклавируемый, стальные иглы, и 2 способ остановить кран. Примечание: Фенол красный добавляется Раствор В легко отличать градиент слоев (табл. 1).
  2. Медленно добавьте следующие решения трубки в порядке, указанном ниже. Следует отметить, что скорость потока не должна превышать более чем на 0,5 мл / сек.
    1. 10 мл TE / ооцисты подвески образца
    2. 8 мл раствора
    3. 8 мл раствора В
    4. 8 мл раствора C
  3. Центрифуга трубке Oak Ridge в 12 000 мкг в течение 60 мин при 4 ° C, без тормозов. Использование фиксированного угла ротора является приемлемым, но высокая скорость размахивая ведром приводит к лучшему разделению ооцист из суспензии образца с минимальным фекальных мазков мусора вдоль боковой или трубки. Степень мазков зависит от состава фекальной подвески и, таким образом это может быть необходимо для выполнения двух CsCl градиенты, если фекальные подвески очень грязная.
  4. После центрифугирования, собирать непрозрачный / белый ооцисты содержащие группы между решениями А и В. Чтобы свести к минимуму загрязнение фекальными мусора, перейти непосредственно к ооцисты группы, не нарушая градиента и собирать ооцисты межфазной использованием 10 мл пипетки. Передача ооцисты межфазной на новый 50 мл коническую трубку центрифуги. Постарайтесь свести к минимуму количество CsCl решение атмосферный время сбора ооцисты интерфазе, как это может создать проблемы в гранулирования ооцист во время мытья шаг.
  5. Мойте ооцист с 30-40 мл DDH 2 О. Центрифуга трубки на 2000 мкг при комнатной температуре в течение 10 минут без каких-либо тормозов. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая ооцисты гранул. Повторите мыть 2 дополнительных раза.
  6. В конце последней промывки, тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мл 2% серной кислоты и хранить при 4 ° С до использования. Ооцист теперь готовы для дальнейшей манипуляции. Ооцисты чистоты может быть проверена микроскопически отсутствие фекальных мусора в образце.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Nichole Бринкман и Майкл Посуда для технического обзора рукописи и д-р Абу-Саид и Линда Ransick технической и административной поддержки. Охране окружающей среды США агентства лице Управления по исследованиям и разработкам частично финансируется и сотрудничал в исследования, описанные здесь по контракту номер EP-D-06-096 для Dynamac, Inc и количество межведомственное соглашение DW-12-92289801-0 Министерство сельского хозяйства США. Он был подвергнут агентства рассмотрения и одобрен для публикации. Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов не означает одобрение или рекомендации к использованию. MJS текущий адрес: Dynamac, Inc Цинциннати, штат Огайо.

Ссылки

  1. Dubey, J. P. Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers. J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).
  2. Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. Toxoplasma gondii: from animals to humans. Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).
  3. Bowie, W. R. Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water. Lancet. 350, 173-177 (1997).
  4. Moura, L. de Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene. Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).
  5. Jones, J. L., Dubey, J. P. Waterborne toxoplasmosis - Recent developments. Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).
  6. Dumetre, A., Darde, M. L. How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples. FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).
  7. Dumetre, A., Darde, M. L. Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient. J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).
  8. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка ооцистсахарозное флотированиефекальная суспензиявысокоскоростное центрифугированиераствор фенолового красногоТЕ-буфердважды дистиллированная водаполикарбонатная пробирка Oak Ridge
Получение высокоочищенного Toxoplasma гондий Ооцист по разрывным градиентом цезия хлорид
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.