Это видео должно популяризировать коллоидных Кумасси G-250 окрашивания протокол в соответствии с Кан Соавт. Для обнаружения среднем 4 нг белка в гелях. Окрашивание выполняется в течение 2 часов и без каких-либо усилий. Мы регулярно использовать протокол Канга для аналитических целей в основе геля протеомики.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Быстро и чувствительной Коллоидное Кумасси G-250 для окрашивания белков в полиакриламидном геле
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кумасси бриллиантовый синий (CBB) является красителя обычно используется для визуализации белков, разделенных SDS-PAGE, предлагая простой процедуры окрашивания и высокий количественный. Кроме того, она полностью совместима с масс-спектрометрического идентификации белков. Но, несмотря на эти преимущества, CBB считается, менее чувствительны, чем серебро или флуоресценции окрашивания и поэтому редко используется для обнаружения белка в аналитической гель подходов протеомных.
Несколько улучшений оригинальной Кумасси протокол 1 были внесены повысить чувствительность CBB. Два основных изменения были внесены для повышения вероятности обнаружения низкого обильные белки путем преобразования молекул красителя в коллоидных частиц: В 1988 году Neuhoff и коллеги применяется 20% метанола и более высокие концентрации сульфата аммония в CBB G-250 решение на базе окрашивания 2, а в 2004 году Candiano и соавт. создана Blue Silver использованием CBB G-250 с фосфорной кислотой в присутствии сульфата аммония и метанола 3. Тем не менее, все эти изменения просто позволить обнаружения приблизительно 10 нг белка. Широко неизвестный протокол для коллоидного окрашивания Кумасси был опубликован Кан и соавт. В 2002 году, где они изменение коллоидного окрашивания CBB Neuhoff в протокол о комплексообразующих веществ. Вместо того, сульфат аммония они использовали сульфат алюминия и метанола была заменена менее токсичны этанола 4. Роман на основе алюминия, окрашивание в исследовании Кан показал высокую чувствительность, которая обнаруживает, даже в 1 нг / полоса (фосфорилазы б) с небольшим изменением чувствительности в зависимости от белков.
Здесь мы демонстрируем применение протокола Канга для быстрого и чувствительного коллоидного окрашивания Кумасси белков в аналитических целях. Мы проиллюстрируем быстрый и легкий протокол, используя двумерный гель регулярно проводится в нашей рабочей группы.
Протокол
Часть 1: двумерные (2-D) гель-электрофореза использованием чашки загрузкой
- IPG-полосы регидратации и изоэлектрической фокусировки (МЭФ)
- Увлажняет Immobiline DryStrip гели, рН 6-11 (7 см) в 125 мкл раствора регидратации [7 М мочевины, 2 М тиомочевины, 4% CHAPS, 50 hydroxyethyldisulfide мм и 2% IPG буфера рН 6-11] с помощью Immobiline DryStrip Reswelling лоток для по крайней мере 10 часов.
- Растворите осажденный образец белка в буфере образца ИЭФ [7 М мочевины, тиомочевины 2 M, 2% CHAPS, 2% АСБ-14, 50 hydroxyethyldisulfide мм и 2% IPG буфера рН 6-11], соответствующие 60-100 мкг белка на 100 мкл .
- После растворения (не менее 30 мин....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Инновационные или просто еще один протокол Кумасси?
На данный момент существует множество протоколов для окрашивания процедуры Кумасси бриллиантовый синий. Большинство из них возникают незначительные или значительные изменения одного из наиболее широко используемых протоколов Neuhoff и коллег 2. Также протокол Канга по формуле Neuhoff в. Но действительно ли это альтернативное окрашивание Кумасси метод протеомных исследований? Мы будем картина два основных вопроса, предел обнаружен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Мне нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим доктора Никола Wiethölter для подготовки и окрашивания 1-D гелей.
Эта работа финансировалась за счет гранта Deutsche Forschungsgemeinschaft (ГРК 1089/project 5 до Н. Д. и С. М.) и при поддержке исследований общении с Юргеном Manchot Stiftung в НД.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Наименование продукта | Компания | Каталог Нет. | Комментарии |
| Для МЭФ и SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip гели | GE Healthcare | 17-6001-94 | Может использоваться даже спустя 2 года после срока годности. |
| Immobiline DryStrip Reswelling лоток | GE Healthcare | 80-6371-84 | Не чистите с органическими растворителями. Предназначен для 7-18 см IPG-полосок. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Включает в себя поднос, держатель электрода, анода и катода электродов, выравниватель и бар образец чашки и стаканы образца. |
| EPS 3501 XL питания | GE Healthcare | 18-1130-05 | Поставки напряжением до 3500 В. |
| Multiphor II группы Электрофорез | GE Healthcare | 18-1018-06 | Подвижные электроды позволяют МЭФ в IPG полос всей длине (7-24 см IPG полос) |
| PerfectBlue гелевой системы Твин S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE в 10х10 см мини-гель формате. Гель камера включает в себя системы охлаждения. |
| Для коллоидных Кумасси G-250 окрашивания: | |||
| окрашивание блюда с крышками | VWR | 216-3412 | Подходит для мини-гелей. Стекируемые на шейкере. |
| сульфата алюминия-18-гидрат | Merck | 1.01102.5000 | Мы сделали лучший опыт Merck. Просто доступен в 5-килограммовой упаковки. |
| ортофосфорная кислота | Prolabo | 20 624.295 | Продается в стеклянных бутылках. |
Ссылки
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
