Выделение и генетических манипуляций взрослых кардиомиоцитов для конфокальной микроскопии

Краткое содержание

Взрослых кардиомиоцитов являются первичные клетки, которые могут быть изолированы от животного сердца и культивировали в течение нескольких дней. В рамках этой культуры периода аденовирусных перенос генов могут быть использованы для выражения генетически закодированы биосенсоров (GEBs) или флуоресцентные белки слияния. Оба подхода позволяют сотовой исследования с помощью конфокальной микроскопии.

Аннотация

Кардиомиоцитов изолированных от взрослых сердца широкое признание в качестве модели где-то на полпути между эмбриональной и неонатальной мышечные клетки с одной стороны и работающем сердце, с другой. Таким образом, кардиомиоцитах служат хорошими моделями для сердечной клеточной физиологии и патофизиологии, для фармацевтических исследований, а также для исследования трансгенных животных моделях. Здесь мы опишем метод выделения клеток из сердца. Кроме того, мы покажем, как генетические манипуляции на кардиомиоциты могут быть выполнены без разведения трансгенных животных: Это сочетание длинных культуры срок (1 неделя) и аденовирусных переноса генов. Последняя описывается от строительства вируса трансдукции клеток. Она может быть использована для выражения генетически закодированы биосенсоров (GEBs), флуоресцентные белки слияния, но и для белка за выражение и вниз регулирования, например, с помощью РНК-интерференции. Здесь мы приведем пример для выражения гибридный белок окрашивания субклеточные структуры (АГ). Такой экспрессии белка могут быть визуализированы с помощью конфокальной визуализации Z-стеки для 3D-реконструкция субклеточных структур. Протокол включает в себя состоянии дел в культуре клеток, молекулярной биологии и биофизики и таким образом обеспечивает подход для изучения новых горизонтов в сотовых кардиологии.

Протокол

За весь дизайн протокол, содержащий четыре основных этапа изображен на рисунке 1. Все шаги описаны во всех подробностях. Сотовые изоляции, трансдукции и культуры, а затем конфокальной микроскопии около 24 часов представляет собой последовательное и обязательное сроки. Вирус строительство должно быть сделано заранее изолятор, а затем используется для генетической трансдукция.

1. Выделение взрослых кардиомиоцитов из сердца крысы

1. Взрослых самцов крыс линии Вистар примерно 250 г в весе (6-12 недель) являются anesthetised на введении препарата в 170 мкл раствора анестезии на 100 г веса
2. Кроме того, цитрата (2 мкл / г веса тела) вводится, чтобы избежать свертывания крови во время операции.
3. Langendorff перфузии Set-Up должны быть подготовлены. Все решения должны быть насыщена кислородом.
4. Когда крыса anesthetised, животного фиксируется на доске и хирургии верхней части тела дезинфицируют 70% этанола.
5. Животное убили, проходящем через сонной артерии.
6. Грудная клетка открывается с помощью ножниц. Сердце и аорте должно быть доступным. Pericard удаляется.
7. Ice-холодный раствор + (5 мл) вводят в обоих желудочках использованием 26-иглы для ареста сердца и промыть крови.
8. Аорта схватил с зажимом и оборвать на дуги аорты просто были первыми ветвление.
9. Сердце удаляется из груди и аорты прилагается к канюли из перфузии настройки по щипцов и зажим, чтобы ретроградный Langendorff-перфузии. Имейте в виду, чтобы не foraminate аортального клапанов.
10. Сердце должно быть исправлено лигатуры вокруг аорты / канюли. Открытые суда также должны быть перевязаны.
11. Сердце ретроградно озарен кислородом насыщенный раствор + при комнатной температуре (23 ° C) в течение 10 мин при давлении примерно 70 мбар. Убедитесь, что нет воздушных пузырей ввести аорты.
12. Перфузии решение переключается на Liberase раствора при температуре 37 ° C в течение примерно 25 мин со скоростью 4 мл / мин с помощью перистальтического насоса. В конце перфузии сердце должно выглядеть мраморными белыми. Пищеварения время, возможно, придется адаптироваться к ситуации / ткани состоянии.
13. Сердце взят из перфузии настройки и помещен в чашку Петри с раствором при температуре 37 ° C. Остальные суда и предсердия обрезаются. Судов отбрасываются и предсердия - при необходимости - трактуются по-разному (не входит в этот протокол). Желудочки разделены на примерно 6 штук.
14. Части переданы в 100 мл колбу Эрленмейера, содержащую 20 мл раствора при температуре 37 ° С и слегка взволнован в 37 ° С на водяной бане 5 мин. Наконец супернатант отбрасывается.
15. Описанная выше процедура повторяется несколько раз. Супернатант должен появиться чуть непрозрачным.
16. Приращение концентрация ионов кальция инициируют добавлением 20 мл раствора B _{1 / 2} на 37 ° C в клетки и ткани Остальные остаточного раствора в колбу. Это немного потрясен в 37 ° С водяной бане в течение еще 5 мин. Впоследствии супернатант отбрасывается.
17. Добавить еще 20 мл раствора B _{1 / 2.} (Решение / супернатант должен содержать жизнеспособных клеток.) ​​Капля клетки передается в чашку Петри на инвертированный микроскоп культуры клеток. Если клетки показывают высокую спонтанную активность (сокращений) нужно ждать, пока клетки приходят, чтобы отдохнуть.
18. Еще раз супернатант отбрасывается и 20 мл раствора В _{1 / 2,} добавил.
19. Кончик пластиковой пипетки Пастера отрезана таким образом, что ткань произведения могут пройти легко, когда взволнованный через отверстие. С пламенем лечения острые края размягчаются (топленое).
20. Теперь ткани куски слегка и осторожно растирают. Ткань части должны "развалиться" в клетки.
21. Ячейку, содержащую надосадочную сливают и разбавляют раствор B для достижения желаемой плотности клеток, которая зависит от типа экспериментов и должна быть определена опытным путем.

2. Строительство аденовирус для синтеза белков трансдукции

Для получения аденовирусы Transpose-Ad Аденовирусные векторной системы от Biomedicals MP используется ^1. Этот протокол начинается с доступных и проверенных вступления вектор (pCR259) для флуоресцентного белка слияния или GEB с ^2.

1. Размере 10 нг выше начальной pCR259 вектора, содержащего ген интереса трансформируется со 100 мкл-1 HighQ Transpose-AD ™ 294 компетентных клеток.
2. Эту смесь выдерживают в течение 20 мин на льду следует теплового шока в течение 45 с при 42 ° С и хранят на льду в течение еще 2 мин.
3. Добавить 900-му; Л неизбирательного LB-средой и расти при температуре 37 ° С при легком помешивании в течение 4 часов.
4. Пластина 50 мкл, 100 мкл и 200 мкл на пластинах содержащих LB-среде с хлорамфениколом (См, 20 мкг / мл), ампициллин (100 мкг / мл), тетрациклину (15 мкг / мл), X-Gal (280 мкг / мл ) и IPTG (40 мкг / мл). (Более интенсивным и быстрее синего окрашивания можно, используя более дорогие красителя Bluo-Гал с 300μg/ml. Это должно быть использовано, в частности, когда вы не так хорошо знакомы в признании и отличительный синий / белый колоний)
5. Вырасти в течение 24 часов при температуре 37 ° C. Оставить при 4 ° С до хорошей идентификации голубые колонии возможно. Когда Есть проблемы решить, какой колонии действительно белый забрать некоторые из колоний и репликации на другую пластину, содержащую трех антибиотиков, X-Gal и IPTG, и пусть они растут в течение ночи при температуре 37 ° C.
   Замечание) HighQ-1 Transpose-AD ™ 294 клетки содержат два важных плазмид: аденовирус позвоночника (Transpose-Ad ™ 294) и помощник плазмиды выражения транспозазы, которая выступает посредником вставка гена в свои сайты цели, находящейся в гене LacZ из Transpose-AD 294 плазмиды.
6. Чтобы определить положительные колонии, содержащие ген интереса к вирусу позвоночник выполняют колонии-PCR, как описано в 2.7-2.9. Использование вектора грунтовки фланговые сайт множественного клонирования (вперед ^{5 'CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG 3',} обратный ^{5 'GCGGATAACAATTTCACACAGG 3')} и сделать ПЦР колонии со 100%-белые колонии и использовать одну синий колонии в качестве контроля за Transpose-AD 294 плазмид без встроенного гена интересов. Синие колонии даст вам краткий фрагмент ПЦР (~ 200bp), колонии содержащий ген проявляют интерес большого продукта ПЦР (в зависимости от длины вашего интересующего гена) и колонии с двумя фрагментами несколько колоний клеток и должны быть отделены если в дальнейшем использоваться.
7. Согласно таблице ниже мастера смесь должна быть подготовлена.
8. Выберите один 100% белый колонии автоклавного зубочистку и сначала повторить этой колонии на LB-пластина с Ст.
9. Передача колонию в ПЦР-смеси. Twirl его в ПЦР-смеси 3-4 раза, чем удалить зубочисткой прежде чем она сможет впитать много ПЦР-смеси. ПЦР-протокола зависит от кб вставлять и использовать полимеразы. Температуры отжига праймеров составляет 57 ° С, а использование 35 циклов рекомендуется.
10. Вырасти за ночь культур (LB-среде с см) положительных клонов и изолировать плазмиды с коммерческой доступны комплект без спина колонны, потому что центробежная сила срывает огромный вектор вируса.
11. Преобразование 0,5 мкг изолированных плазмид в 100 мкл DH5α компетентных клеток. Инкубируйте ДНК с клетками на льду в течение 30 мин. Теплового шока 45 с при 42 ° С и установить на льду в течение 2 мин.
12. Добавить 900 мкл неизбирательного LB-средой и расти при температуре 37 ° С при легком помешивании в течение 1 часа.
13. Пластина 50 мкл на пластину, содержащую LB-среде с Cm, X-Gal и IPTG. Инкубировать при 37 ° С в течение 24 часов.
14. Пика и повторить до 20 100% белые колонии на отдельных ампициллин, тетрациклин и хлорамфеникол чашки, содержащие IPTG и Х-Гал. Пусть они растут в течение ночи при температуре 37 ° C. Выберите колонии, которые на 100% белый, устойчивы хлорамфеникол, ампициллин и тетрациклином чувствительны.
15. Колония-PCR (необязательно): положительные клоны могут быть проверены снова колонии-ПЦР и проверить, что они содержат вставки.
16. Выберите одну колонию положительные рекомбинантных и расти в 600 мл LB-среде с Ст.
17. Изолировать плазмиды использованием плазмиды комплект макси.
18. Дайджест 5 мкг плазмиды с Pac я в течение двух часов при температуре 37 ° С и остановить реакцию при 65 ° С в течение 20 мин.
19. Концентрат целом дайджеста в SpeedVac при комнатной температуре в течение 30 мин до конечного объема 10 мкл или использовать фенол-хлороформ экстракции.
20. Оттепель флакон замороженных QBi-HEK 293 клеток с нежным агитации в 37 ° С водяной бане. Промыть вне флакон с 70% этанола и приступить асептически в стерильные капотом.
21. Передача клетки стерильные 15 мл трубки, добавляют по каплям 10 мл DMEM (+10% FCS), в то время как нежный агитацию и центрифуги 10 мин при 250xg для осаждения клеток.
22. Удалите супернатант. Ресуспендируют гранул в 10 мл DMEM (+10% FCS), осторожно пипетирования вверх и вниз.
23. Семенной в 75 см ² колбу и добавляют 10 мл DMEM с 10% FCS к клеткам. Выдержите в течение ночи при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора.
24. На следующий день проверить плотность клеток. QBi-HEK 293 клетки должны быть разделены на 1:10 до 1:20 отношение.
25. Удаление среды из клеток и trypsinize с 2 мл трипсина в течение 1-3 мин. Дайте 10 мл DMEM в клетки и центрифуге при 250xg течение 10 мин.
26. Удалить тщательно средних и дают 10 мл свежей среды для клеток, ресуспендирования и считать клетки.
27. Пластина в шесть и одна скважина с 2x10 ^5, 3х10 ⁵ , 4x10 ^5, 5x10 6x10 ⁵ и ^{5 клеток.} Инкубируйте блюдо при температуре 37 ° С в СО _{2-инкубаторе.}
28. На следующий день использовать также с 50% слияния для трансфекции с концентрированным Pac я переварить. У нас есть хороший опыт работы с Lipofectamine 2000 трансфекции, но и другими методами (такими как кальций фосфат трансфекции) должны быть подходящими.
29. Изменение средней и 3-4 ч до трансфекции, чтобы получить клетки в экспоненциальный рост во время процедуры.
30. Смешайте 5 мкл Lipofectamine с 250 мкл DMEM и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
31. Дайте Lipofectamine-Medium смеси ДНК (Pac я дайджест) и перемешать, нажав на реакционную трубку, не смешивания с помощью пипетки. Выдержите смесь 20 мин при комнатной температуре.
32. Оставьте смесь для трансфекции клеток и рок пластинка перемешать. Инкубировать при 37 ° C с 5% CO _2. Изменение среде после 4-5 часов.
33. Через два дня после трансфекции принять среды от клеток и отдать его в свежем колбу культуры (75 см ^2).
34. Trypsinize клеток с 500 мкл трипсина на срок до 5 мин. Дайте 1 мл DMEM в клетки, возьмите всю смесь и поместить его вместе с 17 мл свежей среды (DMEM с ФТС) в культуре колбу. Развивайте клетки при 37 ° C с 5% CO _2, пока цитопатический эффект (ЦПЭ) видны. На рисунке 2, чтобы узнать, как CPE должно выглядеть.
35. Сбор клетки со средой, в 50 мл трубку и заморозить клетки при температуре -80 ° C. Перерыв клетки с тремя циклов замораживания / оттаивания (-80 ° С/37 ° С водяной бане).
36. Центрифуга 20 мин при 8000xg и 4 ° C. Декантируйте супернатант в 100 мм диаметром блюдо и отбросить гранул. Используйте стерильный фильтр с размером пор 0.45μm для фильтрата супернатант. Это первая акция вируса (проход 1).
37. Используйте 1 / 3 от этой акции для трансдукции 75см ² колбу с QBi-HEK 293 ячеек с 70% слияния. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂ до CPE с видны.
38. Если клетки показывают, CPE с собирать их и извлекать вирусов как делал раньше. Это отрывок 2 вируса.
39. Повторите шаги 2,37 и 2,38 с вирусом прохождения 2 и так далее, пока усиление вирусов достигает достаточный запас вируса. Вирус может быть сконцентрированы с конкретными труб центрифугирования (Amicon Ультра-15 центробежный фильтр с ultracel-100 мембрану из Millipore) и сохраняется в течение нескольких месяцев при температуре -80 ° C. Для подсчета инфекционных частиц использовать доску анализа.
40. Используйте вирус проход 2 или выше для трансдукции клеток и для дальнейшего усиления вируса.

3. Первичные культуры клеток и аденовирусной трансдукции

1. Стерильные круглый скользит крышка диаметром 20 мм размещаются в стандартных 12-луночных планшетах.
2. 20 мкл раствора ECM равномерно распределяется по каждой покровным стеклом. Останки, отбрасываются. Для сушки следует выдержать минимум 1 час при температуре 37 ° C. Кроме покрытия может по сухой в течение ночи (12 ч) при комнатной температуре.
3. Каждая скважина заполняется 1 мл Средний M199 с приложениями включает антибиотики и ITS.
4. Клеточной суспензии (с шагом 1,21) от 200 до 400 мкл в каждую лунку добавляют. Культивирование клеток происходит при температуре 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора.
5. Клетки имеют право осадка и через 1 ч среда изменилась.
6. Сразу же после изменения среды достаточное количество раствора, содержащего вирус (от прохождения 2 или выше) смешивают осторожно покачайте его тарелку.
7. В случае долгого культуральной среде термин меняется каждые 2 дня.
8. 24 часа после трансфекции выражение GEB может быть обнаружено.

4. Конфокальной микроскопии для 3D субклеточных структур и Са ^{2 +} сигнализации

Конфокальной микроскопии может быть выполнена на любом конфокальной микроскопии. Тем не менее, кальций-изображений эксперименты требуют приобретения скорости не менее видео, частоту (25-30 Гц). Это ограничивает используемым технологиям либо нескольких сканеров пучка (например, диск Нипкова, прокатилась поле или килограмм-лучевой массив сканера) или очень быстро один луч сканера (например, резонансный сканер или акусто оптический дефлектор (AOD)-сканер). Для обзора см.. 3. 3D-визуализация субклеточных требует Z-Drive. Здесь килограмм-лучевой массив сканера (VTinfinity, VisiTech Int., Сандерленд, Великобритания) не используется.

1. Микроскопа и периферийное оборудование должно быть установлено в рабочий режим. Специально для лазерных это может потребовать разогрева период до стабильного мощность будет достигнута.
2. Клетки должны быть переданы в экспериментальной камере (покровное стекло передачи). Покровные стекла с клетками передаются экспериментальной камере. 1 мл Tyrode раствора (содержащего 1,8 мМ внеклеточного кальция) будет добавлена.
3. Экспериментальной камере должен быть помещен на столик микроскопа. Стимуляция электродов, перфузии настройку и дальнейшее peripheRAL устройств, например, контроль температуры, должны быть организованы соответственно.
4. Клетки будут сосредоточены на и выбрать с помощью белого света и / или epifluorescent освещения.
5. Приобретение таким параметрам, как мощность лазера, и т.д. время экспозиции или весь протокол эксперимента должна быть настройки.
6. Временных рядов и / или Z-раздел изображения могут быть приобретены.
7. На настройку дальнейшее развитие многомодовых измерений можно сделать с помощью электрофизиологии (патч-зажим) и / или оптическое манипулирование как флуоресценции после перераспределения photobleach (FRAP) или uncaging веществ, в том числе два фотолиза фотона.
8. Анализ изображений, особенно в 3D-реконструкция осуществляется на специализированное программное обеспечение анализа, таких как Imaris (Bitplane AG, Цюрих, Швейцария), скорость (импровизация, Ковентри, Великобритания) или Arivis браузер (arivis GmbH, Росток, Германия).

5. Представитель Результаты:

Окончательные итоги протокола последовательности изображений, которые могут быть использованы для извлечения дополнительных данных.

Примером может служить исследование субклеточных структур и органелл. На рисунке 3 изображен пример 3-мерного расположение аппарата Гольджи. В отличие от электронной микроскопии все расследования может быть выполнено на живых клетках.

Рисунок 1: Общий поток основных экспериментальных шагов.

Рисунок 2: левое изображение изображает Q-HEK клеток в культуре с 90-95% слияния, которые не трансдуцированных. Cytopatic эффектов после вирусной трансдукции показаны в правой части. Клетки круглые и оторваться от нижней части пластины. В этих клетках ядра занимает большую часть клетки, в результате активного производства вируса.

Рисунок 3: взрослых крыс сердечных миоцитов трансфицированных YFP-синтез белка ориентации аппарата Гольджи. Кардиомиоцитов после аденовирусных переноса генов (один день в культуре) выражают флуоресцентного белка слияния. Группа изображает одну конфокальной ломтик взят из Z-Stack. В панели В той же ячейке изображен после деконволюции использованием теоретической функции рассеяния точки (PSF). Это де-размытое изображение стек впоследствии используется для визуализации клеток и получить 3D-реконструкции объем, как показано на панели C или 3D реконструкции поверхности (D). Бар составляет 10 мкм.

Обсуждение

Процедуре, описанной для выделения кардиомиоцитов крысы могут быть адаптированы для других видов, например, мыши ^4, если это необходимо. Параметром, который необходимо адаптации фермент смесь для пищеварения (см. ниже), а также продолжительность пищеварения. Имейте в виду, что клетки некоторых видов (например, мыши) может быть более хрупкой, чем другие (например, крысы).

Выбор коллагеназы, пожалуй, самый важный шаг в изоляции процедуры. Мы выбираем Liberase Blendzyme, потому что э...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Раствор для анестезии	Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun)		Смесь 1 мл Ursotamin (кетамина гидрохлорид 100 мг/мл) и 240 μRompun (2% ксилазина гидрохлорид)
Цитратный раствор			117,64 мг цитрата натрия в 10 мл 0,9% раствора NaCl
Раствор А			134 мМ NaCl, 4 мМ KCl, 11 мМ глюкозы, 1,2 мМ MgSO44, 1,2 мМ Na2Гистопатологическое исследование4, 10 мМ HEPES, pH доведен до 7,35 с помощью 10 М NaOH, стерильно отфильтровано
Раствор А+			Состав раствора А плюс 0,2 мМ ЭГТА, pH доведен до 7,35 с помощью 10 М NaOH, стерильная фильтрация
Раствор либеразы	Ф. Хоффманн‐ La Roche Ltd.	11988476 001	500 μстоковый раствор в 15 мл раствора А (стоковый раствор: 10 мг/мл Liberase Blendzyme 4 в дистиллированной воде)
Раствор B			Состав раствора А плюс 200 μM CaCl₂2 и 0,1% раствор ДНКазы
Раствор B1/2			смесь раствора А и раствора Б в соотношении 1:1
Раствор ДНКазы	Sigma-Aldrich	D4527	Дезоксирибонуклеаза I, тип 2 из поджелудочной железы быка, 40 КЕ (15 мг), растворяют в 5 мл 10 мM Трис-буфера‐Буфер HCl, доведенный до pH=7,35, дополнительный состав: 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотреола–эритритол; этот раствор смешивают с 5 мл глицерина
Раствор белков внеклеточного матрикса (ВКМ)	Раствор белков внеклеточного матрикса (ВКМ)	E1270	1 мл исходного раствора в том виде, в котором он был приобретен, разводят в 6 мл среды M199
Питательная среда M199	PAA Laboratories	E15‐834	Среда M199 с добавлением 1 μл/мл раствора ITS и 20 μл/мл пенициллина‐раствор стрептомицина (5000 ед/мл)
раствор ITS			25 мг инсулина, 25 мг трансферрина и 50 μРастворяют 2,5 мг селенита в 5 мл дистиллированной воды (сток-раствор: 0,5 мг/мл селенита натрия в дистиллированной воде). Добавляют по несколько капель 1 М HCl до получения прозрачного раствора. Аликоты можно замораживать.
раствор Тайрода			135 мМ NaCl, 5,4 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl22, 2 мМ MgCl22, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES, pH доведен до 7,35 с помощью 10 М NaOH, стерильно отфильтровано
Мастер-микс			5 μл 10×ПЦР‐Буфер, 5 μ1 мг MgCl22 (25 мM), 2 μпрямой праймер 1, 2 μобратный праймер l, 1 μдНТФ´с (по 10 мМ каждого), 33 μl H2О, 1 μл ДМСО, 1 μTaq-полимераза‐ДНК-полимераза для каждого образца
LB (бульон Ленсберга)‐Среда			10 г/л триптона, 5 г/л yeast extract, 5 г/л NaCl (и 15 г/л агара, если используется в качестве твердой среды), pH 7,0
Pac I	New England Biolabs	R0547L	подготовка: 50 μгДНК, 5 μл 10×буфер, 0,5 μл 100×БСА, 0,75 μ1 Пак I, заполнить H2O2до конечного объема 50μl