Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Мы представляем<em> В пробирке,</em> Двухцветного анализа флуоресценции для визуализации слияние одиночных частиц вируса с двухслойной жидкости цели. Называя вирусных частиц с флуорофоров, что дифференциально пятно вирусной оболочки и ее интерьер, мы имеем возможность отслеживать кинетику hemifusion и образования пор.

Abstract

Мембранные слияние является важным шагом в процессе вступления оболочечных вирусов в клетки. Обычные анализы слияние обычно сообщают о большом числе слияние событий, что делает ее трудно количественно проанализировать последовательность молекулярной этапов. Мы разработали в пробирке, двухцветные флуоресценцию ряда анализов для мониторинга кинетики одного слияние вирусных частиц с мишенью на двухслойной жидкости существенно поддержки.

Грипп вирусных частиц инкубируют с зеленым липофильных флуорофора запятнать мембраны и красные гидрофильные флуорофора запятнать вирусных интерьера. Мы депозита ганглиозида содержащих липидного бислоя на декстран-functionilized стеклянной поверхности проточной ячейки, инкубировать вирусных частиц на плоских двухслойных и изображения флуоресценции 100 х 100 мкм ² области, содержащей несколько сотен частиц, на ПЗС камеры. По изображения как красный и зеленый флуоресценции, мы можем одновременно контролировать поведение мембраны красителя (зеленый) и водный контента (красный) частиц.

После снижения рН до значения ниже слияния рН, частицы сливаются с мембраной. Hemifusion, слияние внешнего листовку вирусной мембраны с внешней листовка целевой мембраны, будет видно, как внезапное изменение в зеленой флуоресценции частицы. После последующего слияния двух остающихся дистальных листовки пор будет сформирован и красно-излучающих флуорофора в вирусные частицы будет выпущен под целевой мембраны. Это событие приведет к снижению красной флуоресценции отдельных частиц. Наконец, интегрированная флуоресценции рН-чувствительных флуорофора, внедренного в целевой мембраны отчеты о точном времени рН капли.

Из трех флуоресценцию времени следы, все важные события (рН капли, липидный смешивания на hemifusion, содержание смешивания на порообразования) теперь могут быть извлечены в прямой манере и для каждой частицы в отдельности. Собирая прошедшее время для различных переходов для многих отдельных частиц в гистограммы, можно определить время жизни соответствующих промежуточных продуктов. Даже скрытые промежуточные, которые не имеют прямого флуоресцентного наблюдаемые могут быть визуализированы непосредственно из этих гистограмм.

Protocol

Стеклянная крышка скольжения функционализации

Плоский бислой, используемых в анализе слияния поддерживается на гидратированных фильм декстрана. Декстран выступает в качестве прокладки между плоскими бислоя и стеклянные поверхности. Это предотвращает мембранных компонентов из застревали на поверхности стекла, а также обеспечивает пространство в которой содержимое вирусной частицы может убежать от слияния. Стекла покровные являются функциональными с помощью лечения эпоксидной силан, который позволяет нам химически связь декстран для стекла (Elender и соавт. 1996).

1. Упорядочить 25 мм покровные в керамической стойкой окраски, и места в стойке в баночку или стакан.
2. Заполните контейнер с 10% раствором моющего средства лабораторной посуды класса. Поместите контейнер в ультразвуковой очиститель для 30 минут.
3. Промойте контейнер и покровное стойка с деионизированной водой и залейте 1M гидроксида postassium. Вернуться контейнер для ванны sonicator в течение еще 30 минут.
4. Повторите эту процедуру чистки с использованием ацетона и этилового спирта.
5. Промыть coverlips в воде и сухой.
6. Наконец, чистый покровные с стриптизерша кислородной плазмы в течение трех минут.
7. Последний этап очистки окисляет поверхность, что делает стекло равномерно гидрофильные и реактивная в следующих шагах silanization.
8. Подготовка 0,2% раствор 3-glycidoxypropyltrimethoxy силана в изопропаноле. Погрузите покровных в этом растворе в течение пяти минут.
9. Отменить решение силана и ополосните покровные несколько раз в изопропанола.
10. Покровные теперь покрыты слоем силана, но они должны быть вылечены, чтобы силана к ковалентно связываться с стекла. Место покровных в духовку на 80 градусов по Цельсию в течение одного часа.
11. Хотя покровные являются отверждения, отвешивать декстран 500 и подготовить 30% вес / объем раствора. Предварительный нагрев воды будет способствовать растворению. Мы будем использовать приблизительно 1 мл этого раствора на покровное. После декстран не растворится, defoam решение в вакуумном эксикаторе.
12. Когда silanized покровные закончили лечение, удалить их из керамических стойку и расположить их плашмя на внутри пластиковой коробке морозильнике. Используйте 1 мл пипетки на покрытие верхней поверхности каждой покровное с ~ 1 мл раствора декстрана. Закрыть окно морозильник и оставить в тихом месте на 24-36 часов.
13. Хотя схватив покровные с пластиковыми щипцами, слейте избыток декстран и заменить их в керамической стойке. Промыть покровные несколько раз в воде, и позволяют покровные, чтобы впитать в воде в течение 48 часов. Банку можно осторожно взволнованным на настольные ротатора.
14. Сухие покровные в сушильном шкафу до 80 градусов по Цельсию, а хранить в вакуум-эксикаторе.

Липосомы подготовка

Поддерживаемые бислоев липидного формируются за счет адсорбции липосомы с декстран функционализированных покровное. Адсорбированных липосомы предохранитель друг друга, пока мембрана разрывается и распространяется плоская над поверхностью.

1. Типичная формулировка липосомы, используемые в анализе состоит из 1,2, dioleoyl-Sn-глицеро-3-фосфохолин (ДОФХ), 1-олеоил-2-пальмитоил-Sn-глицеро-3-фосфохолин (ПОФХ), холестерин, мозга быка Disialoganglioside (GD _1а), и N-((6 – (biotinoyl) амино) гексаноил) -1,2-dihexadecanoyl-Sn-глицеро-3-phosphoethanolamine в соотношении 4:4:2:0.1:5 x10 ^-5. Все компоненты хранятся в хлороформа или хлороформа и метанола решений.
2. Приготовить смесь, содержащая два мкмоль липидного путем передачи объемов каждого компонента в стеклянную пробирку. Evaporate растворителя в токе аргона и азота. Удалите оставшийся растворитель, оставляя пробирки в вакуум-эксикаторе в течение двух часов.
3. Ресуспендируют высушенной пленки липидов в 400 мкл буфера HNE (5 мМ HEPES, 145 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА).
4. Передача подвески пластиковую трубку микроцентрифужных. Замораживание суспензии в жидкой ванне азота и оттепели в теплую ванну водой. Повторите эту замораживания / оттаивания цикл в четыре раза.
5. Соберите липидного экструдер с 100 нм поликарбоната мембранный фильтр, и выдавите липидного подвески 25 раз. Подвеска должна оказываются более прозрачными после экструзии.
6. Липосомы должны использоваться на день, когда они готовы. Они могут храниться при комнатной температуре до использования.

Микрожидкостных подготовки проточной кюветы

Простой микрожидкостных проточной ячейки производится сэндвич двойная лента палку между кварцем слайдов и функциональными покровное.

1. Получить 20x20x3 мм кварц слайда. Использование алмазов заусенцев пробурить две 1 мм отверстия на противоположных сторонах.
2. Вырезать 20 мм квадратный из листа двойной ленты палки, и с помощью лезвия бритвы, вырезать 15 х 2 мм участка от центра.
3. Отделите одну сторону ленты поддержку, и придерживаться ленты квартаг слайда. Придерживаться другой стороны, чтобы функционализированных покровное.
4. Вырежьте два 20 см длины полиэтиленовых труб и вставить их в отверстия в кварцевых слайда.
5. Печать проточной ячейке с 5 минут эпоксидным клеем.
6. Когда клей вылечил, премьер-ячейка потока и труб с буфером.
7. Поддерживается липидного бислоя может быть сформирован на данном этапе, привлекая около 80 мкл суспензии в липосомы каналов.

Маркировки вирусной частицы

1. H3N2 гриппа типа А (X-31) обычно используется для слияния анализа, но и другие штаммы гриппа и других вирусов были успешно использованы.
2. Вирус имеет метку с одним или двумя различными флуоресцентными красителями, чтобы обнаружить hemifusion и порообразования.
3. Растворите sulforhodamine б (SRB) в HNE буфера, чтобы сделать 20 мМ раствора. Комбинат 20 мкл раствора красителя с 10 мкл вирусной суспензии, и оставить при комнатной температуре в течение 20 часов. В течение этого периода, краска будет постепенно накапливаться внутри вирусных частиц.
4. Удалите избыток красителя, передавая вирус суспензии через PD-10 обессоливания колонке. Если достаточное количество вирусного материала используется цветная полоса можно увидеть в столбце. Эта группа содержит меченый вирус и может быть собрана как он вымывается.
5. Если нет группы видно, собирают 200 мкл фракций и определить, какие фракции содержат помечены вируса путем измерения поглощения 565 нм на спектрофотометре. Вирус должен элюируются в общем объеме около 0,8 мл.
6. Этикетка вирусной оболочки, добавляя 13 мкл 2 мМ диметилформамиде (DMF) решение октадецил родамина 110 (Rh110C18) для SRB помечены вируса подвески.
7. Движение подвески путем присоединения трубки в лабораторию ротатор и оставить на 3 часа.
8. Purify вируса от избыточного Rh110C18 использованием PD-10 обессоливания колонке, как описано выше.

Микроскоп конфигурации

Эксперимент проводится на флуоресцентный микроскоп оснащен высокими ценами на нефть Н. А. погружения цели подходит для микроскопии полного внутреннего отражения флуоресценции. 488 и 568 нм линий от аргон / криптон газовый лазер используется для возбуждения Rh110C18 и SRB помечены вируса. Одновременная визуализация каждой этикетке осуществляется путем разделения зеленая и красная флуоресценция излучения с дихроичных зеркал и независимо фокусировки изображения на отдельные половинки электронного умножения ПЗС-камерой.

Выполнение Пробирной

Исполнение слияние анализа предполагает ступенчатое сборки биохимических компонентов в проточной ячейке: сборка плоских липидный слой, док-меченых вирусных частиц, покрытие поверхности с флуоресцеин, и начало реакции с низким буфера рН (рис. 1А) .

1. Горы поток-клеток на столике микроскопа, и присоединить шланг к розетке шприцевой насос установлен в потоке со скоростью 40 мкл в минуту.
2. Очистить каналы потока избыточной липосомы путем пропускания в 300 мкл HNE.
3. Фокус микроскопа и регулировать мощность лазера для подсветки поверхности с 350 Вт / см ² 488 свет нм и 70 Вт / см ² 568 нм света. Если вы используете 1,45 NA 60x нефти погружения цели, набор лазерных интенсивностей до 100 микро Вт и 20 Вт микро-, соответственно.
4. Насос помечены вируса (разбавленного 1 / 100) в потоке клеток. Как вирус распространяется на нижней поверхности канала течения, частицы начнут придерживаться ганглиозида включены в липидный бислой.
5. Когда подходящая плотность стыковки вирусные частицы достигнут (до около 1000 частиц в поле зрения). Переключатель входа трубы в растворе, содержащем две микрограмм на миллилитр флуоресцеина меченый стрептавидин. Меченый стрептавидин связывается с биотином связанных молекул липидов в бислой, и в итоге тусклый зеленый фон будет виден.
6. Вымойте течения в канале с 300 мкл HNE.
7. Выберите область изображения, фокус микроскопа и подготовить ПЗС-камеры для времени истек получения изображений. Установить время экспозиции до 100 мс и собирать кадры со скоростью 10 Гц.
8. Инициировать синтеза, протекающей в кислой буфера, содержащего 10 мМ цитрата натрия и 140 мМ NaCl. РН буфера должна быть скорректирована на уровне ниже критического рН вируса анализировали. Х-31 предохранителей при рН ниже 5,5.

Представитель Результаты

На рисунке 1б показывает снимки бислоя пристыкован вирионов до и во время синтеза. Каждый дифракционного предела пятно представляет отдельные частицы вируса. Красная и зеленая флуоресценция были отдельно отображаемого на верхней и нижней половин ПЗС-камерой, что позволяет одновременное наблюдение вирусной оболочки и содержание этикетки. Есть правило, в два раза больше мест в зеленый канал по сравнению скрасный, и это отражает меньшую эффективность маркировки на содержание красителя по сравнению с конверте этикетки. Зеленая флуоресценция фоне излучаемый поверхностью связана флуоресцеина исчезает по прибытии цитрат буфера и позволяет определить время начала реакции синтеза. Hemifusion события определяются как всплески зеленая флуоресценция как закаленных Rh110C18 в вирусную диффундирует через конверт hemifusion стебля и разводят в плоской мембране. Внешние расширения флуоресцентного облака можно увидеть вокруг hemifused частиц, демонстрируя свободное распространение жирных ацил связан красителя в плоские мембраны. Порообразования наблюдается как распад красной флуоресценции от SRB в ловушке внутри вирусной частицы. Открытие слияния пор позволяет красителя убежать в водном пространстве под плоский бислой и из области наблюдения.

Флуоресценция траекторий интенсивности для каждой частицы, построенных по интегральной интенсивности отдельных частиц, способствовать определению урожайности и времена hemifusion и образования пор (рис. 1в). Раз Hemifusion и порообразования событие определяется как точка, в которой максимальный наклон Rh110C18 флуоресценции взорваться или SRB сигнал распад происходит. В успешного эксперимента, около 50 процентов частиц помечены Rh110C18 выход dequenching сигналов, а 30 процентов SRB помечены частицы дают полезной сигнала. Из частиц маркированы как красители, примерно 10 процентов показать и липидного смешивания и поры сигналы образования.

Рис. 2A-C показывает распределение hemifusion и поры времена формирования отставание от типичного эксперимента. Fig.2D-F показывает событие распределения событий комбинированный из пяти экспериментов в тех же условиях. Даже со скромным количеством наблюдений, форма гистограмм является очевидным. Потому что каждый эксперимент синхронизируется при обнаружении время падение рН, многочисленные эксперименты могут быть объединены и подробную информацию с ограничением скорости промежуточных шагов могут быть получены.

Рисунок 1. Экспериментальный дизайн. ) Вирусные частицы помечены с двумя флуоресцентными красителями для контроля кинетики hemifusion и формирование слияния поры. Флуоресценции собирается высокого Н. А. объектива микроскопа и отображаемого на ПЗС. Б) флуоресцентные изображения до (слева) и во время (справа) слияние отдельных вирусных частиц. Верхняя и нижняя половина каждого изображения соответствуют красной и зеленой флуоресценции, соответственно, такой же площади ~ 50 х 100 мм ² из поддерживаемых бислоя. С) интенсивность флуоресценции красного SRB вирусных трассирующими содержание (верхний луч), зеленый Rh110C18 мембраны красителя (в середине следа), и датчик рН флуоресцеина (нижний луч) обеспечивают точное время, прошедшее между рН капли, hemifusion и синтеза. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 1.

Рисунок 2. Fusion кинетики флуоресцентно меченого вируса. Распределение времени между падением рН и hemifusion (A, D) и порообразования (В, Е). Нарастания и спада распределений указывает на наличие нескольких промежуточных шагов. Переход между hemifusion и открытие поры слияния для отдельных частиц экспоненциально распределенных, предлагая единый ограничение скорости шага. Панели переменного тока показывают результаты одного эксперимента. Панели DF собираются из пяти отдельных экспериментов в тех же условиях. Пожалуйста, нажмите здесь , чтобы видеть большую версию рисунке 2.

Discussion

Подготовка жидкости и непрерывного поддерживается бислоев липидного может оказаться непростой задачей. Следовые количества загрязняющих материалов или дефекты поверхности будут препятствовать распространению бислоев. Тщательная очистка и осаждение равномерным слоем декстран имеют важное значение.

Длительное изображений вирусных частиц может отбелить флуоресцентные метки или причинить им стать инактивируется. Фото-повреждения такого рода является хорошо известный в био-изображений и отдельных полей молекулы и, как полагают, связаны с генерацией активных форм кислорода возбужденного флуорофоров. Чтобы свести к минимуму фото-повреждения, мы, как правило минимизации мощности лазерного возбуждения и избегать длительного воздействия до начала эксперимента. Истощение кислорода из буфера с одним из нескольких кислорода очистки системы, сообщенные может оказаться полезным.

Возможность получить информацию о переходных промежуточных состояний требует, чтобы реакция синтеза быть точно синхронизированы. Скорость потока используются и мертвые объема трубы входа и течения в канале ячейки являются факторами, которые могут ограничить синхронизации. Fusion инициируется обмен нейтральным буфером для кислых рН. Однако, как кислый буфер проходит через впускной трубопровод в проточной ячейке, интерфейс между двумя буферами смесей путем диффузии и становится все менее хорошо определены. В результате градиента рН на поверхности двойного слоя стремится к размытости определения времени начала. Кроме того, поскольку слияние кинетики зависит от концентрации протонов, градиента рН в начале эксперимента могут осложнить интерпретацию результатов. В эксперименте показано здесь, кинетика плавления намного медленнее, чем время перехода рН и эффект градиента не оказывает существенного влияния слияния кинетики. В настоящее время мы работаем над изменениями в наших клетках поток, который позволил бы нам премьер входе трубки с желаемыми буфера затем повернет поток в потоке клеток.

Materials

Corning cover glass squares, 25 mm	Sigma-Aldrich	CLS286525
Fused silica slides	Technical Glass
Staining rack	Thomas Scientific	8542E40
(3- glycidoxypropyl)trimethoxysilane	Gelest Inc.	SIG5840.1
Dextran T-500	Pharmacosmos	5510 0500 4006
1,2-dioleoyl-<em>sn</em>-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850375
1-palmitoyl-2oleoyl-<em>sn</em>-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Avanti Polar Lipid, Inc	850457
Cholesterol	Avanti Polar Lipid, Inc	700000
<em>N</em>-((6-(biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-dihexadecanoyl-<em>sn</em>-glycero-3-phosph–thanolamine, triethylammonium salt (biotin-X DHPE)	Invitrogen	B1616
Streptavidin, fluorescein conjugate	Invitrogen	S-869
Disialoganglioside GD<sub>1a</sub> from bovine brain	Sigma-Aldrich	G2392
Mini Extruder	Avanti Polar Lipid, Inc	610000
0.1 micron polycarbonate membrane filters	Whatman, GE Healthcare	800309
10 mm drain discs (membrane supports)	Whatman, GE Healthcare	230300
Sulforhodamine b sodium salt		S1402
Octadecyl rhodamine 110 (Rh110C18)			<em>See</em> Floyd <em>et al.</em> 2008 for synthesis protocol
PD-10 desalting columns	GE Healthcare	17-0851-01
Nikon fluorescence microscope	Nikon Instruments	TE2000-U
Plan Apo TIRF 60x 1.45 NA objective	Nikon Instruments
Innova 70C Spectrum Ar/Kr laser	Coherent Inc.
Syringe Pump	Harvard Apparatus	702213