Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ретро-орбитальный инъекций у взрослых данио рерио

25.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1645

⸱

7 декабря 2009 г.

 ,  ,  , 
1Department of Hematology and Oncology, Children’s Hospital Boston, 2Harvard Stem Cell Institute, Harvard Medical School, 3Department of Medical Oncology, Dana Farber Cancer Institute

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы показываем, как это сделать ретро-орбиту у взрослых рыбок данио.

Аннотация

Медикаментозное лечение целых животных является важным инструментом в любой модели системы для фармакологической и химической генетических исследований. Внутривенно (IV) инъекции часто является наиболее эффективным и неинвазивной формой доставки агентов, представляющих интерес. В данио (

Протокол

Часть 1. Подготовка материала инъекции

  1. Tg (глобина: GFP) клеток:
  2. Bleed взрослых рыб доноров использованием 10ul кончиком пипетки покрытие гепарином (1unit/ul), чтобы проколоть рыбу за жабры.
  3. Аспирируйте красных кровяных клеток и обойтись в ячейке буфера (PBS 0.9x + 5% ЭТС + 1% Pen / Strep).
  4. Фильтры суспензии клеток за 40uM сетки и определения концентрации клеток с использованием гемоцитометра, как описано выше по Лебланк и соавт.
  5. Спином вниз и ресуспендируют в ячейке буфера при нужной концентрации, что окончательный объем инъекций составляет не более 5ul. Здесь мы вводим 1,5-2 млн. кл / получателя.
  6. Для декстран, Texas Red ®, растворить краситель в DPBS для конечной концентрации инъекции 10-12 мг / мл. План для введения 4 мкл на рыбу.

Часть 2. Инъекция

  1. Обезболить рыбы в tricaine (4.2ml (4mg/ml) tricaine/100ml рыбы вода).
  2. Вымойте Гамильтон шприца 3-4 раз перед инъекцией с использованием 70% этанола. Промыть 3-4 раза с 0,9 x DPBS.
  3. Место рыб спинной стороной вверх и вправо на влажной губкой.
  4. Держите шприц Гамильтон со своей правой рукой и указательным пальцем на поршень. Аккуратно стабилизировать тело рыбы с левой рукой.
  5. Расположите иглу с коническими вверх, что если глаз с рыбой были часы, стрелка будет указывая на 7:00 позиции и на 45 градусов к рыбе (рис. 1).
  6. Осторожно введите иглу 1-2 мм в 7:00 позицию и медленно нажмите поршень.
  7. Разрешить рыбы для восстановления в пресной воде E3.
  8. Вымойте иглы, как описано выше, между инъекциями различных реагентов.
  9. Флик клетка решение для ресуспендирования клетки каждые несколько минут, чтобы предотвратить слипание ячейки.
  10. Хранить рыбу с потоком в течение 1 недели с ежедневными изменениями воды, чтобы избежать инфекции. Мы продолжаем рыба в воде ICU за этот период (10 мл Стресс пальто + 5 мл + 5 мл pemafix MelaFix на 38 литров воды E3).

Часть 3. Представитель Результаты

Когда выполнены правильно, то можно представить себе вводили материал, если он был назван в некотором роде. Например, Tg (глобина: GFP) эритроцитов следует рассматривать под флуоресцентного микроскопа рассечение, циркулирующей в сосудистой рыбы получателя Каспер вскоре после инъекции, как показано на рисунке 2. Кроме того, введение 70kDa декстран, сопряженных с Texas Red ® могут быть визуализированы в сосудистую прозрачной рыбы сразу же после ретро-орбиту (рис. 3). Флуоресцентные клетки почки от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы также может быть введен ретро-орбитально в облученной рыбы получателя Каспер. Эти клетки в конечном итоге домой к получателю мозга (рис. 4а), а затем может перейти к населить почек после нескольких недель (рис. 4б).

Если инъекция слишком мелко или угол иглы обходит ретроорбитального венозных синусов полости, вводимый материал может быть визуализированы объединения вокруг глаз или вытекающих из него. Кроме того, если инъекция слишком глубоко, рыбы могут возникнуть повреждения тканей или чрезмерное кровотечение, хотя они все еще может восстановиться. При правильном выполнении смертности после ретро-орбиту должно быть не менее 5% от общего числа вводили рыбу и успех доставки крови должно быть больше 90% от общего числа вводили рыбу.

Рисунок 1
Рисунок 1: Иллюстрация ретро-орбиту техники. Правый глаз рыбы представляется как аналоговые часы, в которых 7:00 позиция соответствует правильном месте инъекции.

Рисунок 2
Рисунок 2: Tg (глобина: GFP) красные кровяные клетки, циркулирующие в сосудистую хвоста взрослой рыбы Каспер три дня после ретроорбитального инъекции.

Рисунок 3
Рисунок 3: Успешное введение 70kDa декстран конъюгированных с Texas Red ® используется как краситель производит люминесцентные сосудистую в прозрачном взрослых рыб, Каспер и легко просматривать с помощью стандартных целом микроскопии флуоресценции животного.

Рисунок 4a
Рисунок 4а: три дня после ретро-орбиту целой почки клеток костного мозга от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы, клетки могут быть визуализированы самонаведения для почек мозга облученных рыбы Каспер получателя взрослых.

Рисунок 4b
Фигура4b: четыре недели после ретро-орбиту целой почки клеток костного мозга от Tg (β-актина: GFP) донора рыбы, заселение реципиента почки с зелеными доноров целые клетки мозга почек могут быть визуализированы в облученной рыбы Каспер получателя взрослых.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ретро-орбиту у взрослых данио дает наибольшую эффективность доставки вводят материал в кровоток с самой низкой частоты смертности. Из-за характера инъекции месте прокола кажется заживают быстро, уменьшая возникновения инфекции и объем кровопотери. Сайте, могут быть даже неоднократно вводили в течение короткого времени для ежедневных инъекций наркотиков, например.

Большое количество наркотиков должны быть приобретены для традиционных методов лечения у взрослых рыб, в которых рыба просто погру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

Эта работа проводится при поддержке Медицинского института Говарда Хьюза и грант NIH для изучения эмбрионального кроветворения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Натриевая соль гепарина из слизистой оболочки кишечника свиньиSigma-Aldrich2106Предварительно взвешенный флакон, содержащий 300 единиц по стандарту USP
Трикаин-SWestern ChemicalMS-222
Дульбекко’фосфатно-солевой буферный растворInvitrogen14190-144
Декстран, Texas Red®Molecular Probes, Life TechnologiesD1830
E35 мМ NaCl
0,17 мМ KCl
0,33 мМ CaCl22
0,33 мМ MgSO42
Микролитровый шприцHamilton Co80300701N 10 мкл SYR (26 с/2”/2)

Ссылки

  1. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as route of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal. 37, 26-32 (2008).
  2. Pinkerton, W., Webber, M. A method of injecting small laboratory animals by the ophthalmic plexus route. Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 116, 959-961 (1964).
  3. White, R. M., Sessa, A. S., Burke, C., Bowman, T., LeBlanc, J., Ceol, C., Bourque, C., Dovey, M., Goessling, W., Burns, C. E., Zon, L. I. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  4. LeBlanc, J., Bowman, T. V., Zon, L. I. Transplantation of whole kidney marrow in adult zebrafish. J. Vis. Exp. , (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ретроорбитальная инъекциямодель zebrafishфлуоресцентный красительфлуоресценция всего организматрансплантация клетокгемопоэтические стволовые клеткипипетка с гепариновым покрытиемфлуоресцентная микроскопиярыбки линии Casperдекстран Texas Red
Ретро-орбитальный инъекций у взрослых данио рерио
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.