Прямое наблюдение Ферменты Репликация ДНК Использование одиночных молекул ДНК Растяжка Пробирной

Summary

Мы опишем метод для наблюдения реального времени репликации отдельных молекул ДНК посредничестве белков системы репликации бактериофагов.

Abstract

Мы опишем метод для наблюдения реального времени репликации отдельных молекул ДНК посредничестве белков системы репликации бактериофагов. Линеаризованные λ ДНК модифицируется, чтобы биотина на конце одной цепи, и дигоксигенин фрагмент на другом конце той же цепи. Биотинилированного конец крепится к функционализированных покровного стекла и digoxigeninated конец небольшой шарик. Сборка этих ДНК-бусинка тросов на поверхности проточной ячейке позволяет ламинарного течения, которые должны применяться приложить силы сопротивления на шарик. В результате ДНК растягивается вблизи и параллельно поверхности покровного на силу, которая определяется по скорости потока (рис. 1). Длина ДНК измеряется мониторинга положение валика. Длина различия между одно-и двухцепочечной ДНК используются для получения информации в реальном времени от активности белков репликации на вилку. Измерение положения шарик позволяет точно определить ставки и processivities ДНК размотки и полимеризации (рис. 2).

Protocol

1. Шаблон репликации ДНК

ДНК для реакции линеаризованной ДНК λ изменены отжига олигонуклеотиды для формирования репликации вилкой. Кроме того, биотин прикрепляется к концу одной нити ДНК λ, и дигоксигенин фрагмент присоединен к другому концу той же цепи ^1.

Материалы: Бактериофаг λ ДНК, олигонуклеотиды: биотинилированного руку вилку (: 5'-биотин-AAAAAAAAAAAAAAAAGAGTACTGTACGATCTAGCATCAATCACAGGGTCAGGTTCGTTATTGTCCAACTTGCTGTCC-3 '), λ-дополнительных вилкой руку (B: 5'-GGGCGGCGACCTGGACAGCAAGTTG GACAATCTCGTTCTATCACTAATTCACTAATGCAGGGAGGATTTCAGATATGGCA-3'), вилка праймера (C: 5 ' -TGCCATATCTGA....

Discussion

Важно, чтобы гарантировать, что сила сопротивления, действующая на бисер по ламинарного потока не влияет на ферментативную деятельность репликации белков. Например, 3 пН сила, которая соответствует скорости потока 0,012 мл / мин не влияет на репликацию ДНК, ведущей нити. Она тем не менее влияют на ферментативную деятельность, которая состоится в ходе скоординированной синтеза ДНК, и поэтому она должна быть уменьшена до 1,5 PN. Сила сопротивления может быть легко регулируется путем изменения скорости потока или ширине по.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Бактериофаг λ ДНК	New England Biolabs	N3011L
ДНК олигонуклеотиды	интегрированные технологии ДНК
T4 ДНК-лигаза	New England Biolabs	M0202L
T4 Полинуклеотидкиназа	New England Biolabs	M0201L
&альфа;-дигоксигенин Fab	Roche Group	11214667001
активированные тозилом гранулы	Магнитный сепаратор Invitrogen	142-03
	Invitrogen	Dynal MPC
3-аминопропил-триэтоксисилан	Sigma-Aldrich	A3648	Другие аминосиланы могут быть использованы или смешаны с неаминными реактивными силанами для более разреженных поверхностей
Сукцинимидилпропионат PEG	Nektar		Аналогичные ПЭГ можно приобрести в Nanocs, CreativePEGWorks и т. Д.
Biotin-PEG-NHS	Nektar		Аналогичные ПЭГ можно приобрести в компаниях Nanocs, CreativePEGWorks и т. Д.
Двухсторонний скотч	Grace Bio-Lab Inc.	СА-С-1Л	100 #x03BC; m
толщина Кварцевая горка	Техническое стекло	20 мм (Ш) x 50 мм (Д) x 1 мм (В)	Размер для размещения на покровных стеклах. Сверление отверстий алмазными сверлами (DiamondBurs.net)
Полиэтиленовые трубки	BD Biosciences	427416	внутренним диаметром 0,76 мм, 1,22 OD Могут быть заменены трубки другого размера.
Стрептавидин	Sigma-Aldrich	S4762	Make 1 мг/мл раствора, 25 μ L аликвоты в PBS pH 7.3
Смесь растворов дезоксирибонуклеотидтрифосфата	New England Biolabs	N0447
Инвертированный оптический микроскоп с 10-кратным объективом	Olympus Corporation	Olympus IX-51
Пермамент редкоземельный магнит	Национальный импорт	www.rare-earth-magnets.com
ПЗС-камера	QImaging	Rolera-XR Fast 139
Шприцевой насос	Harvard Apparatus	11 Plus	Работа в режиме заправки для облегчения смены раствора
Fiber Illuminator	Thorlabs Inc.	ОСЛ1