Мы представляем экспериментальные методики измерения парциальное давление кислорода (рО2) в мозговой сосудистой на основе кислорода зависит от тушения фосфоресценции. Подготовка животных и визуализации процедур были определены как для больших поле зрения ПЗС основе изображений рО2 у крыс и 2-фотонного возбуждения основана изображений рО2 у мышей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Церебральный измерения оксигенации крови на основе кислорода зависит от тушения фосфоресценции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мониторинг пространственно-временных характеристик оксигенации церебральной крови и тканей имеет решающее значение для более глубокого понимания нейрометаболических и сосудистых взаимосвязей. Разработка новых методов измерения pO2 с одновременным мониторингом pO2 в более широких полях зрения с более высоким пространственным и/или временным разрешением позволит лучше понять функционирование здорового мозга, а также окажет значительное влияние на диагностику и лечение нейроваскулярных заболеваний, таких как инсульт, болезнь Альцгеймера и черепно-мозговые травмы.
Методы оптической визуализации продемонстрировали большой потенциал в обеспечении высокого пространственно-временного разрешения и количественного определения pO2 на основе поглощения гемоглобина в видимом и ближнем инфракрасном диапазонах оптического спектра. Однако мультиспектральное измерение оксигенации церебральной крови зависит от миграции фотонов через сильно рассеивающую ткань мозга. Для точной оценки оксигенации крови обычно требуется расчет и моделирование оптических параметров ткани, которые могут динамически изменяться в ходе эксперимента. С другой стороны, определение парциального давления кислорода (pO2) на основе кислородно-зависимого тушения фосфоресценции не должно существенно зависеть от изменений оптических параметров ткани и обеспечивает абсолютное измерение pO2. Экспериментальные системы, использующие кислородно-чувствительные красители, были продемонстрированы в исследованиях in vivo на перфузируемых тканях, а также при мониторинге содержания кислорода в культурах тканей, что показало, что тушение фосфоресценции является эффективной технологией, способной обеспечить точную визуализацию кислорода в физиологическом диапазоне pO2.
В данном видео с помощью двух различных методов визуализации демонстрируется способ измерения pO2 в сосудах коры головного мозга на основе визуализации времени жизни фосфоресценции. В первой демонстрации представлена визуализация pO2 с широким полем зрения на поверхности коры крысы. Этот метод визуализации имеет относительно простую экспериментальную установку на базе ПЗС-камеры и импульсного зеленого лазера. Приведен пример мониторинга распространяющейся корковой депрессии на основе времени жизни фосфоресценции красителя Oxyphor R3. Во второй демонстрации представлена двухфотонная визуализация pO2 с высоким разрешением в микрососудах коры мыши. Экспериментальная установка включает специально сконструированный двухфотонный микроскоп с фемтосекундным лазером, электрооптическим модулятором и фотоумножителем с системой счета фотонов. Мы приводим пример визуализации гетерогенности pO2 в микрососудах коры, включая капилляры, с использованием нового красителя PtP-C343 с увеличенным сечением двухфотонного возбуждения.
Нажмите здесь, чтобы просмотреть соответствующую статью Синтез и калибровка фосфоресцентных нанозондов для визуализации кислорода в биологических системах.
Протокол
1. Широкое поле зрения изображения рО2 в корковых сосудистой от крыс
- Крысы (250 г -350 г) первоначально анестезировали изофлуран и бедренную артерию и вены катетер для контроля частоты сердечных сокращений, артериальное давление и газы крови, а также для внутривенного вливания. Температура тела поддерживается на уровне 37 ± 0,1 ° С. Трахеотомия производится, и крысы, вентилируемые с смесь воздуха и кислорода.
- Пробы крови для измерения газов крови берутся каждые 30-45 мин и вентиляции и анестезии корректируются, чтобы сохранить газов крови в пределах нормальных физиологических пределах.
- Закрытой черепно окна на теменной кости 4 мм х 4 мм готова для работы с изображениями. Кости и оболочки удаляются и черепно окно содержит 1,5% агарозном и печатью с помощью микроскопа покровное. Дополнительно 1 мм 2 заусенцев отверстия на лобной кости используется, чтобы вызвать КУР по интракортикальных микроинъекции KCl (~ 10 мкл, 1 М). Экстремальные следует позаботиться, чтобы избежать повреждения коры сосудов. Избыточное тепло, механическое давление, или короткий период гипоксии может поставить под угрозу крови барьер мозга и вызвать утечку красителя из сосудистую в интерстициальном пространстве.
- Маска из оптически непрозрачного материала, расположенных вокруг черепа окна. Цель маска для поглощения фосфоресценции сигнал, который исходит от красителей, которые просочились в ткань от краев вопрос оболочки. Красителя в интерстициальное пространство является источником очень яркого фосфоресценции, которые могут испортить измерения. Повышенной яркости красителя в интерстициальном пространстве является результатом накопления красителя в среде с низким давлением кислорода и низкой скоростью закалки. Повреждение сосудистой в эксперименте, следовательно, легко узнать по появлению ярких пятен фосфоресценции, в этом случае экспериментальные данные отвергается.
- После завершения операции, изофлуран прекращается и анестезии переключается на alphachloralose (50 мг / кг внутривенно болюсно затем 40 мг / (кг ч) инфузия).
- Животное переходит на корзину с вентилятором, кровяное давление и температуру монитора. Хотя дыхании комнатным воздухом, животное быстро перешел к визуализации настройки и подключить к расходомер с соответствующей смеси воздуха и кислорода.
- Стереотаксическая рамка, которая держит животное находится под цели. Черепной окно находится в центре поля зрения под объективными и располагаться параллельно фокальной плоскости.
- Импульсный лазер включен и настроен на минимальную энергию импульса. Оптический луч направлен импульс счетчика энергии и энергии импульса доставлены образцы регулируется быть не более 10 мДж / см 2. Луч МКС по центру черепа окно с косым углом частоту ~ 60 градусов и лазерной МКС выключена.
- Кровь газа измерения и регулировки систем вентиляции и анестезии выполняются, пока все физиологические параметры животных находились в пределах нормальных физиологических пределах.
- Предполагая, что объем крови составляет около 7% от массы тела, соответствующее количество фосфоресценции R3 Oxyphor зонда, растворенного в 1 мл физиологического раствора для достижения 4 х 10 -5 М концентрацию в крови зонда. Зонд решение вводится через бедренную вену.
- 1 М раствора хлористого калия готовят и ~ 1 мкл вводят со шприцем через отверстие заусенцев на лобной кости, чтобы побудить КУР.
- Лазер включен и изображений устанавливается сразу же после инъекции KCl решение. Визуализация фосфоресценции выполняется в течение ~ 10 мин.
- Другое измерение газов крови проводят для подтверждения, что животные физиологических параметров по-прежнему в пределах нормы.
- Фосфоресценции жизни Получены все пиксели путем установки одной экспоненты распада использованием нелинейных установки квадрат со статистических весов в Matlab. Фосфоресценции жизни превращаются в рО2 значений с помощью эмпирических Стерн Фольмера-подобные отношения (см. ниже).
2. Высокое разрешение двухфотонных рО2 изображений в корковых микро-сосудистой от мыши
- Мыши анестезировали isofluorene и бедренной артерии катетер для контроля частоты сердечных сокращений, артериальное давление и газы крови, а также для введения красителя. Температура тела поддерживается на уровне 37 ± 0,1 ° С и животные спонтанно дыхания смесь воздуха и кислорода.
- Черепной окно подготовлен в соответствии с техникой, первоначально разработанная Дэвидом Кляйнфельд и Винфрид Денк. Хороший уход должны быть приняты, чтобы избежать любых повреждений сосудистой, чтобы предотвратить возможные утечки красителя в интерстициальном пространстве.
- Несколько образцов крови для измерения газов крови взяты во время всей процедуры подготовки и вентиляции и анестезии корректируются, чтобы сохранить газов крових годов в пределах нормальных физиологических пределах.
- Животное перемещается в визуализации установки. Изменение стереотаксическая рамка, которая держит животное находится под цели. Черепной окно находится в центре поля зрения под Olympus 4X объективных и располагаться параллельно фокальной плоскости.
- Образ черепа окна берется с цифровой камеры через окуляры, и 4X цель заменяется Olympus 20X цели (NA = 0,95).
- Кровь газа измерения и регулировки систем вентиляции и анестезии выполняются, пока все физиологические параметры животных находятся в пределах нормальных физиологических пределах.
- Предполагая, что объем крови составляет около 7% от массы тела, соответствующее количество фосфоресценции зонд PtP-C343 растворяется в 0,2 мл физиологического раствора для достижения ~ 15 мкМ крови концентрации зонда. Зонд решение вводится через бедренную артерию.
- Начать эксперимент, установив желаемые временные интервалы для химчисток возбуждения и эмиссии коллекции для каждого пикселя.
- Приобретать обзор сканирование, которое является медленное 2-мерной растровой разверткой фосфоресценции распада интенсивности, которая отображает структуру сосудистой на текущей глубины. Цель перемещается перпендикулярно черепной окна (Z ось) и медленное 2D сканирует обзор фосфоресценции интенсивности, сделанные с использованием минимальной мощности лазера на 840 нм, чтобы найти микрососудов в плоскости воспроизведения.
- На каждом изображений глубина, на основе обследования сканирования фосфоресценции на этой глубине, множество точек внутри сосудистой выбраны, и запись фосфоресценции распады в каждой точке повторяется для заданного числа усреднения.
- Установите желаемую сумму усреднения, интервал измерений, а продолжительность эксперимента и начать измерение. рО 2 измерения, полученные в отдельных местах на указанный интервал измерений на протяжении всего эксперимента.
- Во время измерений, программное обеспечение перенаправляет лазерного возбуждения в определенных местах, изменяя положение зеркала гальванометра сканирования. Контроль гальванометра сканеры, электро-оптического модулятора, и все другое оборудование, выполняются на заказ программное обеспечение в LabView.
- Фосфоресценции жизни получаются для всех выбранных точках путем установки одной экспоненты распада использованием нелинейных монтаж площади Matlab. Фосфоресценции жизни превращаются в рО2 значений с помощью эмпирических Стерн Фольмера-подобные отношения (см. ниже).
- После сбора данных в различных корковых глубины, вводят декстран-сопряженных флуоресцеина красителя в сосудистой для работы с изображениями микроциркуляторного структуры.
- Получить стека структурных образов сосудистую, выполняя двухфотонного визуализации FITC флуоресценции с помощью зеленого канала в четырех-канальный детектор.
- Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Massachusetts General Hospital подкомитета по научным исследованиям по Уходу за животными.
3. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Panel (а) в левой части этого рисунка показывает широкое поле зрения образ давления кислорода до прихода волны КУР. Панель (б) на правой стороне показывает временную эволюцию среднего давления кислорода во время КУР распространения в регионе интерес отмечен на панель ().
Рисунок 2 (ролик фильма): Этот фильм показывает временной эволюции давления кислорода во всей черепной окна при распространении волны КУР. Шкала полоса указывает на давление кислорода в миллиметрах ртутного столба.
Рисунок 3. 3D проекции отображаемого стек сосудов. Оттенки серого представляют объемные маски судно, созданное на основе структурных изображения. Измеренные значения рО 2 имеют цветовую маркировку. Шкала бар составляет 200 микрометров. Переизданный с разрешением от природы Group Publishing 7.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы продемонстрировали два приложения рО2 измерения в корковых микрососудов на основе кислорода зависит от тушения фосфоресценции. В то время как первый метод, основанный на ПЗС-изображений обеспечивает широкое поле зрения контроля рО2, измерительные парциальное давление кислорода в корковых микрососудов на основе 2-фотонной микроскопии обеспечивает капиллярную разрешение и позволяет изображений в глубину. Оба метода обеспечивают высокую скорость и высокое отношение сигнал-шум измерений. Кроме того, измерения фосфоресцен...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотели бы отметить поддержку от американского Национального института здравоохранения грантов R01NS057476, P50NS010828, P01NS055104, R01EB000790, K99NS067050, R01HL081273 и R01EB007279 и Американской ассоциации сердца грант 0855772D.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Гликопирролат | Реагент | American Regent Inc. | NDC 0517-4605-25 | Используется для контроля секреции глотки, трахеи и бронхов. |
| Лидокаина гидрохлорид | Реагент | Hospira Inc. | NDC 0409-4277-01 | Используется для местной анестезии во время хирургических вмешательств. |
| Изофлуран | Реагент | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-360-40 | Используется в качестве общего ингаляционного анестетика при хирургических операциях и для общего наркоза при экспериментах с мышами. |
| Альфа-хлоралоза | Реагент | Sigma-Aldrich | C0128 | Используется для общего наркоза при экспериментах с крысами. |
| Флуоресцеин-изотиоцианат–декстран | Реагент | Sigma-Aldrich | FD2000S | Вводится для достижения концентрации в крови ~ 500 nM. |
Ссылки
- Kleinfeld, D., Friedman, B., Lyden, P. D., Shih, A. Y. Targeted occlusion to surface and deep vessels in neocortex via linear and nonlinear optical absorption, Animal Models of Acute Neurological Injuries. Contemporary Neuroscience Series. Chen, J., Xu, Z., Xu, X., Zhang, J. , Humana Press Inc. (2007).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J Vis Exp. , (2008).
- Lebedev, A. Y., Cheprakov, A. V., Sakadzic, S., Boas, D. A., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A., A, S. Dendritic Phosphorescent Probes for Oxygen Imaging in Biological Systems. Applied Materials & Interfaces. , (2009).
- Finikova, O. S., Lebedev, A. Y., Aprelev, A., Troxler, T., Gao, F., Garnacho, C., Muro, S., Hochstrasser, R. M., Vinogradov, S. A. Oxygen microscopy by two-photon-excited phosphorescence. Chemphyschem. 9, 1673-1679 (2008).
- Sakadžić, S., Yuan, S., Dilekoz, E., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Ayata, C., Boas, D. A. Simultaneous imaging of cerebral partial pressure of oxygen and blood flow during functional activation and cortical spreading depression. Appl Opt. 48, D169-D177 (2009).
- Yaseen, M. A., Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Wu, W., Ruvinskaya, S., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Optical monitoring of oxygen tension in cortical microvessels with confocal microscopy. Opt Express. 17, 22341-22350 (2009).
- Sakadzic, S., Roussakis, E., Yaseen, M. A., Mandeville, E. T., Srinivasan, V. J., Arai, K., Ruvinskaya, S., Devor, A., Lo, E. H., Vinogradov, S. A., Boas, D. A. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nat Methods. 7, 755-759 (2010).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
