Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Магнитно-резонансной спектроскопии живых Дрозофилы С помощью магии прядильной Угол

12K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/1710

⸱

15 апреля 2010 г.

 ,  ,  , 
1NMR Surgical Laboratory, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Shriners Burn Institute, 3Department of Radiology, Athinoula A. Martinos Center of Biomedical Imaging, Harvard Medical School, 4Molecular Surgery Laboratory, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

В этой статье

Краткое содержание

Эта технология позволяет использовать с высоким разрешением магическим углом спиннинг протона МР-спектроскопия (HRMAS 1H-MRS) для молекулярных характеристик живых Дрозофилы С обычными 14,1 тесла спектрометр оснащен датчиком HRMAS.

Аннотация

Высокого разрешения магическим углом Спиннинг (HRMAS) протонной магнитно-резонансной спектроскопии (

Протокол

Часть 1: Подготовка дрозофилы для измерения HRMAS

  1. С помощью стандартных процедур flylab 1, собирают вновь eclosing мух в течение 3 дней и передачи им летать флаконах, содержащих свежие продукты летать. Инкубируйте собранных мух в течение 5 дней, чтобы мухи станут 5-8 дней непосредственно перед экспериментом. Только одного пола (обычно мужчины) используется для экспериментов.
  2. Используйте здоровые, неповрежденные дикого типа мухи сравнить с обработанными например, травмированные или генетически измененных мух 1.
  3. Место одного летит в 2 мл пробирки, содержащие часть (~ 0,2 мл) летучей пищи за 24 часов до эксперимента. Эти трубки медведя отверстие в трубке чашку с использованием пламени нагревают инсулина иглу.
  4. Взвесьте трубы непосредственно до и после вставки летать использованием высоких баланс точности и определить вес каждого летать с вычитанием первое значение из последнего. Одного мужчины летают весит обычно 0,7-1 мг.

Часть 2: Подготовка HRMAS ротора.

  1. Место одной трубки на льду в течение менее чем за минуту, чтобы обезболить летать внутри.
  2. Положите летать на слой алюминиевой фольги помещают на лед и нажмите летать мягко в полусферической полые пространства вставить ЯМР ротора с помощью мягкой щетки, чтобы обеспечить полное включение летать, избегая при этом летать травмы.
  3. Место вставить оксида циркония (ZrO 2) трубы ротора (4 мм в диаметре, 50 мкл), чтобы найти мухи между ротором вставки и нижней части ротора (см. рисунок 1).
  4. Закрыть вставка с винтом и покрыть ее парафильмом (см. рисунок 1), чтобы предотвратить контакт между летать и решение TSP стандарт (TSP: триметилсилил-пропионовая-2 ,2,3,3-d4 кислоты, Mw = 172, δ = 0,00 промилле, 50 мм в дейтерированных водой D 2 O, которые функционируют в качестве ссылки для сдвига резонанса химического и количественного).
  5. Добавить 8 мкл TSP стандартное решение на верхней части ротора вставки. (См. рисунок 1).
  6. Безопасные и затянуть весь созданный в роторы с верхней крышке (см. рисунок 1).

Часть 3: HRMAS сбора данных

  1. Ввести ротора в зонд HRMAS и расположите его под магическим углом 54,7 ° (см. рисунок 1).
  2. Установите температуру на 4 ° С BTO-2000 блок в сочетании с единицы пневматического МАС. Мухи хранить при температуре 4 ° С в то время как в спектрометр для поддержания анестезии.
  3. Установить HRMAS 1 H МРС спиннинг ставка в 2 MAS кГц.
  4. Стабилизация частоты вращения MAS на 2,0 ± 0,001 кГц контроллер MAS скорость (частота вращения).
  5. Для магнит приготовления: настройка и соответствуют катушки для оптимальной производительности и прокладку магнитом для оптимального качества спектров.
  6. Приобретать одномерных 1 H спектров с использованием ротора синхронизированы Карр-Перселл-Мейбума-Гилл (CPMG) спиновое эхо последовательности импульсов 2, [90 ° - (τ-180 ° - τ) п приобретения], который работает как T 2 фильтра удалить уширения спектра ЯМР 1 Н одном лету спектров приобретенных одномерных данных по всем образцам. Синхронизация между задержки импульса (τ = 500μs) с частотой вращения MAS (2 кГц). Установить число переходных процессов при 256 с 32 768 (32k) точек данных. Приобретение время 9 мин.
  7. Приобретать двумерных (2D) 1 H-1 H ЯМР HRMAS одного лету спектры на всех образцах использованием TOBSY последовательность импульсов с адиабатическим 3. Приобретение параметрами являются: 2k точек данных прямого измерения (11 частей на миллион ширина спектра), 1 с водой предварительно насыщения в процессе релаксации задержки, 8 сканирований в прирост, 128 шагом, общее время повторения 2 сек, 45 мс, время перемешивания, и в общей сложности приобретением время 29 мин.

Часть 4: Обработка данных / Анализ

  1. Анализ образцов MRspectra использованием MestReC программное обеспечение (Mestrelab исследований, www.mestrec.com)
  2. Используйте уширения аподизации функцией 0,5 Гц и применяются ко всем HRMAS 1 H FIDS до преобразования Фурье.
  3. Ссылка спектров MR по отношению к TSP в δ = 0,0 промилле (внешний стандарт).
  4. Фазы спектров вручную и применять базовые оценки Уиттекер вычесть основных компонента базового до пика расчетами области.
  5. Оценка площадей пиков использованием MestReC программного обеспечения. Шкала высот пиков по отношению к TSP для каждого приобретенного спектра (TSP высота пика = 1). Использование Т-тестов (с двумя хвостами, р <0,05), для сравнения в группе, чтобы между-групп коэффициентов.
  6. 2D параметры TOBSY процесса являются: QSINE = 2 функция окна в обоих измерениях, FT с 2k точек в прямом измерении и нулевой наполнения 1k во втором измерении, фазовую коррекцию в обоих направлениях и коррекция базовой линии во втором измерении.
  7. Продукция 2D-спектров с использованием программы Спарки (TD Годдарда и Д. Г. Неллер, SPARKY 3, USCF, http://www.cgl.ucsf.edu/Главная / Sparky /)

Часть 5: Представитель спектры от игрового мухи дрозофилы

Процедур, описанных выше разрешение собирать воспроизводимых спектров от живых мух Drosophila MELANOGASTER. На рисунках 2 и 3 показаны спектры представитель MR, приобретенных в дикого типа (WT) Орегон-R мух. На рисунке 2 представлены 1D 1 H HRMAS CPMG спектров. Основные компоненты липидного [C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1.58ppm), С H 2 C = C (2,02 промилле), С H 2 C = O (2,24 промилле), C H = C H (5,33 промилле)], глицерина (1,3-C H 4,10 промилле и 4,30 промилле; 2-CH 2 5,24 промилле), и малых метаболитов: β-аланина (β-Ala , 2,57 промилле), ацетат (Ас, 1,97 промилле), фосфохолин (PC, 3,22 промилле) и phophoetanolamine (ПЭ, 3.23ppm) были обнаружены и присваивается в соответствии с предыдущих докладах 4, 5. Сигналы на 2,02 промилле были назначены на метиленовых протонов C H2-CH = CH фрагмент моно-ненасыщенных жирных кислот (т.е. пальмитолеиновой). Ненасыщенных кислот были определены сигнала на 5,33 промилле производства протонов-CH = CH-группу. Малый метаболиты, которые не могут быть назначены или не были видны использованием 1D спектра были обнаружены с помощью 2D-1 Н-1 Н TOBSY HRMAS (см. рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1. Экспериментальная настройка в естественных условиях HRMAS 1H MRS для исследования живых дрозофил на 14,1 Т. Внешний стандарт триметилсилил-пропионовая-2 ,2,3,3-d4 кислоты в дейтерированных воды (TSP / D 2 O). На площади: положение ротора под магическим углом в HRMAS зонда.

Рисунок 2
Рисунок 2. В естественных условиях 1D HRMAS 1 H CPMG спектры жить дрозофилы летать MELANOGASTER вес. Липидных компонентов: C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1.58ppm), ацетат (Ас), С H 2 C = C (2,02 промилле), C H 2 C = O (2,24 промилле), β-аланина (β-Ala), фосфохолин (ПК) и phophoetanolamine (PE), глицерин (1,3-C H 4,10, 4,30 промилле; 2-C 2 H 5,22 промилле) , C H = C H (5,33 промилле).

Рисунок 3
Рисунок 3. В естественных условиях 2D 1H-1H TOBSY HRMAS спектр жить дрозофилы вес летать на 14,1 Т. Малый метаболитов и липидных компонентов были определены. Метаболиты: аланин (Ala), β-аланина (β-Ala), аргинина (Arg), глютамин (Gln), глутамата (Glu), ПК фосфохолин (ПК), phophoetanolamine (PE), таурин (Тау), α-глюкозы (α-GLC) и глицерин. Липиды компонентов: C H 3 (0,89 промилле), (С H 2) л (1,33 промилле), С H 2 C-CO (1,58 промилле), С H 2 C = C (2,02 промилле), С H 2 C = O (2,24 промилле), C H = C H (5,33 промилле).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

За исключением последнего доклада возможности в естественных условиях МРТ у плодовых мушек 6, в естественных условиях MRS исследования у дрозофилы до сих пор не сообщалось. В настоящее время протокол, мы описываем реализацию романа в естественных условиях HRMAS 1 H-MRS подход для выявления биологически важных молекул. В частности, мы обнаружили липидов и малых метаболитов в живых мухи дрозофилы составляет 14,1 т в примерно 45 мин, что позволяет достаточн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными Massachusetts General Hospital Институциональный комитет Исследования животных Review Board.

Благодарности

Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья (NIH) предоставлять AI063433 к Лоуренс Г. Rahme, Национального института Институтов Здоровья (NIH) Центр Грант (P50GM021700) Рональда Г. Томпкинс (А. Ария Tzika, директор основные ЯМР), и больница Шрайнер по делам детей исследовательского гранта (# 8893) А. Ария Tzika. Мы благодарим Dionyssios Mintzopoulos кандидат за помощь в начальные фазы развития этого протокола и Овидиу С. Andronesi кандидат за помощь в TOBSY импульсной последовательности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оксид дейтерияРеагентSigma-Aldrich7789-20-0
3-(триметилсилил)пропионовая-2,2,3,3-d4 кислотаРеагентSigma-Aldrich24493-21-8
агар, сахароза, дрожжи, кукурузная мукаКормGenesee Scientifichttp://www.flystuff.com/
мухи линий Oregon RS или Canton-SЛинии взрослых мухЦентр стоков Блумингтонаhttp://flystocks.bio.indiana.edu/
Кисть для рисованияОборудование(размер 0)
пробирки объемом 2 млОборудованиеFisher ScientificK749521-1590
Инкубаторы для мухОборудованиевысокая влажность (60–75%), регулируемая температура и световой цикл 12 ч свет : 12 ч темнота.
ЯМР-спектрометр Bruker Bio-Spin Avance (600,13 МГц) с 4-мм зондом для тройного резонанса (1Н, 13C, 2H) Зонд HRMAS ОборудованиеBruker Corporation
Устройство BTO-2000 в сочетании с пневматическим блоком MASОборудованиеКорпорация Bruker
ротор из диоксида циркония 4 мм (вместимость 50 мкл)ОборудованиеBruker CorporationB3829 (магазин Bruker)
MestReC (Mestrelab Research) Программное обеспечениеАнализ одномерных ЯМР-спектров
http://mestrelab.com/
SPARKY 3, USCFПрограммное обеспечениеАнализ 2D ЯМР-спектров
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

Ссылки

  1. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
  2. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
  3. Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
  4. Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
  5. Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
  6. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
  7. Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in vivo
Магнитно-резонансной спектроскопии живых Дрозофилы С помощью магии прядильной Угол
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.